葡萄根癌病研究进展及防治措施

袁丽芳，尹向田，王鹏飞，李廷刚，蒋锡龙，汤小宁，韩金涛*，魏彦锋*

（1. 山东省葡萄研究院，山东济南 250100；2. 山东省农药科学研究院，山东济南 250100）

我国是葡萄大国，2020年栽培面积达76.75万 hm2，排世界第二位。葡萄根癌病是常见的细菌性病害，在我国葡萄产区发生普遍，主要为害树体主干，影响树体健康生长，给葡萄产业带来了巨大损失。

葡萄根癌病由葡萄土壤杆菌（Allorhizobium vitis）引起，植株染病后生长衰弱、葡萄品质下降，产量降低，严重者植株死亡[1-3]。此外，该病原多从伤口进行侵染，因此葡萄嫁接苗存在感病风险，若用带菌苗木建园，一旦发病只能销毁。对葡萄根癌病进行快速诊断和检测是进行有效预防的前提，目前农业防治和生物防治是防治该病的首要方法。本文对国内外葡萄根癌病的研究进展进行综述，并提出常规防治措施，以期为葡萄根癌病的后续研究提供帮助。

1 危害及田间症状

葡萄根癌病（也称冠瘿病，crown gall disease）是葡萄生产中的一种毁灭性细菌病害，给世界范围内的葡萄育苗基地和种植园带来巨大的经济损失[3-5]。在我国东北、华北、西北、黄河及长江流域地区均有根癌病发生，部分葡萄园发病率高达80%～90%，产量损失30%～70%，严重时甚至绝收[4-5]。

葡萄根癌病的典型症状是形成肿瘤[6-7]。该病的病原菌主要存活在病残体或土壤中，通过伤口侵入植物体内，由木质部进行传输到达植物细胞，使细胞产生过量的生长激素，从而形成瘤状物[8]。葡萄幼苗期，在嫁接部位可形成大小不一的瘤状物，初期为黄豆粒大小，外皮绿色，随着瘤状物逐渐膨大呈现直径数厘米的球形，表面粗糙，内部组织逐渐木质化，后期颜色变为褐色或深褐色。随着葡萄树龄的增加，除主干外，瘤状物可出现在主枝、侧枝和结果母枝上[3]。此外，根癌病病原菌可破坏葡萄植株根冠对水和矿物质的吸收，影响植株形成层和维管束对营养的运输，导致植株营养不良，枝梢干枯，严重时可导致藤蔓死亡。

2 病原菌

2.1 病原菌的种类及分类

土壤杆菌包括根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）、发根土壤杆菌（A. rhizogenes）、悬钩子土壤杆菌（A. rubi）和葡萄土壤杆菌（A. vitis）[5,9-10]。当菌株携带肿瘤诱导质粒（tumor-inducing plasmid, Ti plasmid，Ti质粒）时就引起根癌病。根据根瘤中诱导产生冠瘿碱的类型，Ti质粒可分为章鱼碱型（octopine）、章鱼碱/黄瓜碱型（octopine/cucumopine）、胭脂碱型（nopaline）、农杆碱型（agropine）和vitopin型[3]。目前，基于基因组信息恢复并修订了土壤杆菌属（Agrobacterium）和其它根瘤菌属（Allorhizobium）的分类地位，根癌土壤杆菌和悬钩子土壤杆菌属于土壤杆菌属，发根土壤杆菌划归在根瘤菌属（Rhizobium）。葡萄土壤杆菌（Allorhizobium vitis），之前命名为Agrobacterium vitis、Agrobacterium biovar 3、Rhizobium vitis，被重新划分为异根瘤菌属（Allorhizobium）[10-14]。

葡萄根癌病的病原菌主要是不同冠瘿碱类型的葡萄土壤杆菌[15-17]。在少数情况下，根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌也可以引起葡萄根癌病[18-22]。葡萄土壤杆菌最初由Ophel和Kerr于1990年定名为Agrobacterium vitis，该病原菌分布广泛，许多国家包括澳大利亚[23]、保加利亚[24]、德国[25]、意大利[4]、日本[26]、塞尔维亚[27]、西班牙[28]、美国[29]、俄罗斯[30]和摩洛哥[31]等，均分离鉴定到该病原菌。在我国山东、河北及新疆等地区引起葡萄根癌病的病原菌为葡萄土壤杆菌章鱼碱型[32-34]。

2.2 形态特征及生理生化特性

葡萄根癌病是革兰氏阴性菌，呈短杆状，大小为0.8～1.0 μm×3.0 μm，具周生鞭毛；菌落乳白色，圆形，边缘整齐。最适生长温度28 ℃，高于37 ℃不能生长，可在pH4～10范围生长，耐受0～3%的NaCl[35]。不同于根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌，该病原菌多数可在pH4.5条件下分解果胶，但在pH7条件下缺乏运动性（表1）[32,36]。

表1 葡萄土壤杆菌、根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌的生理生化特性Table 1 Comparative analysis of physiological and biochemical characteristics of A. vitis with A. tumefaciens and A. rhizogenes

2.3 基因组信息

目前，全基因组测序的葡萄土壤杆菌菌株共有9株，分别是S4、VAR03-1、VAT03-9、F2/5、CG412和VAR06-30等（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/browse/#!/prokaryotes/1215/）。葡萄土壤杆菌的基因组大小为5.57～6.32 Mb，包含有两个环形染色体和1～5个质粒，GC含量为57.48%～58.61%。根癌土壤杆菌和发根土壤杆菌大多含有一个环形染色体和一个线性染色体，GC含量为58.92%～59.96%，与葡萄土壤杆菌相比较高（表2）[37]。葡萄土壤杆菌的Ti质粒大小约200 kb，GC含量56%～57%，包含转运DNA（transferred DNA，T-DNA）、毒力区域（virulence region）、冠瘿碱代谢基因（opine catabolism genes）、复制区（replication region）和可结合转运的基因（conjugative transfer genes）[38]。Ti质粒属于repABC质粒家族，含有两套独立的TypeIV分泌系统，第一个T4SS系统（vir）是负责将T-DNA从细菌转移到宿主植物，而第二个系统（tra/trb）则介导Ti质粒的偶联转移。Ti质粒的结合转移由群体感应（quorum sensing，QS）调控，受冠瘿碱的产生而诱导。

表2 土壤杆菌基因组信息比较Table 2 Comparison of genomes information of Agrobacterium sp.

2.4 寄主范围

土壤杆菌是引起植物根癌病的一种世界范围内的致病菌，可以引起包括葡萄在内的93科331属的643个种的植物根癌病[39-40]。根癌土壤杆菌可以侵染多种植物，包括葡萄、苹果、樱桃、猕猴桃、玫瑰、番茄等[41-44]；发根土壤杆菌可以侵染苹果、梨、扁桃和樱桃[45-48]；葡萄土壤杆菌主要侵染葡萄，还可以侵染香蕉，引起香蕉叶枯病[49]。葡萄土壤杆菌能在向日葵、烟草、蕃茄、曼陀罗、悬钩子等几种植物上形成瘿瘤，通常采用这几种植物为指示植物在温室内做致病性测定[38]。

3 葡萄土壤杆菌的致病机理

通过伤口侵入寄主体内，将自身Ti质粒上的T-DNA整合到寄主细胞核DNA中，从而引发葡萄根癌病。葡萄土壤杆菌的致病能力主要由Ti质粒决定，Ti质粒包含4个保守的功能基因区：T-DNA区，包括致瘤基因区和冠瘿碱合成相关基因区；毒性Vir区，包括Vir A、Vir B、Vir C、Vir D、Vir E、Vir F六个遗传位点；Tra区，促使细菌质粒在细菌间的接合转移和群体信号感应；rep区，参与质粒复制。T-DNA区的冠瘿碱合成相关基因，包括章鱼碱合成相关基因（ocs）、黄瓜碱型合成相关基因（cus）、胭脂碱合成相关基因（nos）、精氨酸合成相关基因（vis）和农杆菌素碱合成相关基因（acs），它们参与冠瘿碱合成，为病原菌提供赖以生存、繁殖所必需的营养和能量；致瘤基因区基因调控生长素和细胞分裂素的合成，生长素的合成需要基因iaaM和iaaH参与，iaaM编码色氨酸侧链氧化酶（tryptonphan side-chain oxidase），催化色氨酸成吲哚乙酰胺（indoleacetamide,IAM）；iaaH编码吲哚-3-乙酰胺水解酶，催化IAM成吲哚乙酸（indoleacetic acid，IAA），ipt是细胞分裂素合成的必需基因，在一些菌株中，T-DNA中不存在iaaM、iaaH和ipt，6b基因具有和iaaM等相似的功能，生长素和细胞分裂素的过量合成打破了寄主植物细胞内激素原有的平衡，导致植物细胞无限制地增生，进而形成肿瘤[38,41]。

表3 葡萄土壤杆菌的特异性引物信息Table 3 Specific primer information of A. vitis

此外，多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase）和游动性是葡萄土壤杆菌所具有的特性，是该病原菌中非常重要的致病因子[50]。葡萄土壤杆菌可以产生多聚半乳糖醛酸酶，诱导葡萄根部坏死[18,51-52]；群体感应系统是细菌的一种调控机制，参与调控多种生理过程，包括营养或位点竞争、毒性基因的表达、细菌Ti质粒的接合转移、细菌趋化性和运动性、生物膜的形成、定殖能力等。游动性葡萄土壤杆菌具有在葡萄上稳定定殖的重要机制，其游动性是由群体感应系统信号分子N-酰基高丝氨酸内酯类（N-acyl-homoserine lactone signal molecules）所调控。研究表明，葡萄土壤杆菌aviR（属于群体感应luxR家族）基因由于缺失突变体菌株丧失了表面游动性[53]。

4 葡萄土壤杆菌的鉴定及检测

葡萄主要依靠扦插和嫁接的方式进行繁殖，带菌的苗木是葡萄根癌病快速传播的重要途径。葡萄土壤杆菌主要生活在葡萄根冠及周围土壤中，能在葡萄藤蔓上生存和繁殖。该病原菌通过木质部在葡萄体内扩展，对植株进行系统侵染。因此，快速准确的检测技术是预防该病的前提。近些年，分子生物学检测技术的快速发展为病原菌的检测奠定了基础。相比传统的特异性检测培养基，PCR检测技术因具有快速、灵敏度高、特异性强等优点被广泛应用。基于PCR检测技术建立的葡萄土壤杆菌的检测体系有特异性引物检测，该技术可以定性鉴定葡萄土壤杆菌菌株[4,54-55]；荧光定量PCR（qPCR）检测技术可以快速对葡萄土壤杆菌进行定性和定量分析，检测用时短且灵敏度高、特异性强[4,56]；磁珠捕获杂交定量PCR（Magnetic Capture Hybridization, MCH-qPCR）指DNA提取经磁珠捕获杂交处理，检测结果比直接进行荧光定量灵敏度提高1000倍[57-58]；数字微滴PCR（ddPCR）不依赖基因扩增循环数和内参基因即可确定基因拷贝数[59]；环介导等温扩增（Loop-mediated isothermal amplification, LAMP）检测技术不需要精准的PCR仪，在恒温水浴下即可完成，其检测结果可进行可视化观察[60]。Lim等[61]根据葡萄根癌病菌葡萄土壤杆菌的特异性DNA片段设计引物，利用巢式PCR进行检测，其灵敏度为2 cfu·mL-1，能够有效检测土壤中的病原菌。Nguyen-Huu[62]设计了5对引物分别进行荧光定量PCR检测，这5对引物均能特异地检测出葡萄土壤杆菌，灵敏度为100 cfu·mg-1。施文骁[34]建立的LAMP技术可用于田间快速检测，对葡萄土壤杆菌DNA的灵敏度为20 pg，60～90 min就可完成。

5 综合防治

目前，葡萄根癌病最有效的防治措施是建立无病原菌的育苗基地，因为没有特别有效的防治方法。植株一旦染病将导致减产、甚至植株死亡。近年来，针对葡萄根癌病主要通过农业防治和生物防治进行。

5.1 农业防治

建园时使用无毒苗木，避免引进带病的种苗是预防根癌病的前提。选育无病苗木和栽植抗病品种是预防葡萄根癌病的重要途径[63]。目前，鲜食葡萄中‘红地球’‘玫瑰香’‘巨峰’等品种高度感病，‘龙眼’‘康太’等品种对根癌病有一定抗性；酿酒葡萄中‘霞多丽’‘赤霞珠’‘黑比诺’也有一定抗性。此外，根癌病抗性葡萄砧木有‘河岸2号’‘河岸6号’‘河岸9号’等[64-65]。因此，对葡萄根癌病菌的早期诊断，及时清除和销毁病苗，并加强田间管理，增施有机肥和矿质营养，尽量避免在农事操作时造成伤口，都可以减少根癌病的发生。

5.2 生物防治

生物防治是根癌病的有效措施，非致病菌A.radiobacterK84可以有效防治不同寄主植物的根癌病，该菌产生的细菌素（农杆菌素）对根癌病菌有抑制作用，但是对于葡萄土壤杆菌引起的葡萄根癌病无防效[66]。无致病性的A. vitisE26、VAR03-1和ARK-1可作为生防菌来抑制土壤杆菌的生长和葡萄植株肿瘤的形成[67-78]。E26菌株可以稳定的产生细菌素，其在温室和田间对葡萄根癌病有显著的防治效果，并且对土壤环境及微生物无风险。分离自葡萄上的A. vitisF2/5能抑制致病的葡萄土壤杆菌，但同时可以引起葡萄根部坏死[69]。室内试验表明，假单孢菌（Pseudomonasspp.）和水生拉恩氏菌（Rahnella aquatilisHX2）可以抑制指示植物根瘤的形成[70]。此外，商品生防制剂枯草芽孢杆菌Bacillus subtilisSR63和木霉菌Trichoderma asperellumT1可以有效抑制葡萄土壤杆菌。

多聚半乳糖醛酸酶可以降解葡萄木质部细胞壁的组成成分果胶[71]。近年来，有研究利用噬菌体的展示技术筛选分离出一种多肽SVTIHHLGGGS，该多肽可以紧密结合在葡萄土壤杆菌中的多聚半乳糖醛酸酶。室内试验证明，该多肽可以降低多聚半乳糖醛酸酶活性35%[72]，效果显著。此外，葡萄土壤杆菌不同菌株中效应蛋白（Tae4）和免疫蛋白（Tai4）变异较大，能否利用免疫蛋白进行病害防治还需后续研究[73]。