外源植物激素对‘赤霞珠’葡萄冬芽萌发的影响

张鸿雁，陈莉，屈嘉燕，李少华，曾青青，张鹏，管雪强，张克坤，房玉林*，陈可钦*

（1. 西北农林科技大学葡萄酒学院，陕西杨凌 712100/西北农林科技大学合阳葡萄试验示范站，陕西合阳 715300/西北农林科技大学宁夏贺兰山东麓葡萄酒试验示范站，宁夏永宁 750104；2. 山东省葡萄研究院，济南 250100/山东省酿酒葡萄与葡萄酒技术创新中心，山东烟台 265608）

与其他多年生植物类似，葡萄进化出了冬季休眠策略，以抵御寒冷威胁。冬芽休眠不仅是葡萄生存的有效生物学特性，也是影响葡萄生产经济性的生物学事件。休眠和萌发是两个连续的生物过程，芽休眠是温带落叶果树的一种适应机制[1]，在休眠期间，植物生长受到抑制，细胞分裂受阻，呼吸和代谢活动减缓，使植物适应季节性环境变化，并能够在恶劣的冬季环境中生存，只有在环境适合时芽才能进入萌发状态。在休眠阶段，芽的萌发受到外部或内部信号的抑制，根据抑制信号的不同，可将每年的休眠周期划分为3个阶段：类休眠（Paradormancy，PD）、内休眠（Endodormancy，ED）和生态休眠（Ecodormancy，ECD）[2]。类休眠是由分生组织外的因子引起的植物生长暂停，本质上是一个器官对另一个器官的影响，例如芽的顶端优势。内休眠发生在寒冷月份，此时芽的发育受到分生组织或附近组织中生理因素的调控，如低温或光周期变化[3]，触发了芽向内休眠的转变，在此阶段，温度或营养供应（碳水化合物、营养素等）的增加无法刺激芽重新生长。生态休眠标志着休眠的最后阶段，此时芽已经恢复了生长能力，但受到不利气候条件的影响没有萌发，通常发生在内休眠完成后（已满足低温要求）。

植物激素信号转导是调节植物生长发育的重要信号通路[4]，控制着植物生长发育的大多数路径。植物激素在整个生命周期中调节发育和生长，并触发由环境变化和生物或非生物胁迫等外部刺激诱导的适应性反应。植物激素自发现以来一直是人们研究的热点，影响着植物生长发育的方方面面。近年来，大量植物激素的合成、信号途径等突变体被分离、鉴定，相应基因被克隆和研究，使人们对于植物激素在调控植物芽的生长发育方面也有了比较深入的了解。大量研究表明，许多植物激素参与了芽休眠的高度复杂的协调过程[5-9]，尤其是生长素、脱落酸和赤霉素。生长素被认为在类休眠中起重要作用，调控葡萄芽从类休眠向生长期转变[10]；随着时间的推移，在单芽扦插中，生长素生物合成基因的表达增加，强烈表明生长素促进葡萄芽萌发[11]。长期以来，外源赤霉素一直被用于打破休眠和促进芽萌发，但其在解除休眠中的作用因物种而异[12]。在葡萄芽自然休眠过程中，赤霉素生物合成基因的表达水平通常在休眠解除期间增加[13]；脱落酸被认为是进入休眠的关键内部因素，并参与休眠诱导和维持[7]，并且在内休眠阶段是芽生长的主要抑制因子[10]；脱落酸水平的增加是植物芽和种子休眠的开始[14-15]。目前，不同激素对葡萄冬芽萌发的影响已有研究，但不同激素间作用效果的差异以及各类激素的作用机制还有待进一步挖掘。

本研究以一年生的‘赤霞珠’枝条为试材，研究不同外源激素处理下葡萄冬芽的萌发和发育状况，并检测不同处理下冬芽过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（OFR）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、以及植物淀粉、果糖（FT）、可溶性糖和总蛋白质含量，阐明冬芽萌发过程与生理生化特性的相关性，为葡萄冬芽萌发调控措施的制定提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

供试材料‘赤霞珠’于2018年定植在陕西省杨凌农业示范区西北农林科技大学曹辛庄葡萄示范基地。株行距1.5 m×3 m，南北行向，常规管理。

1.2 激素处理

于2022年2月26日，采集长势一致、无病害的一年生枝条，选择健壮、饱满的冬芽，上切口平剪、下切口斜削，制备单芽插条。

基于实验室前期研究的葡萄冬芽相关激素检测结果（数据未发表），选择使用200 mg·L-1脱落酸（ABA）、25 mg·L-1的吲哚-3-甲酸（ICA）、20 mg·L-1赤霉素（GA7）、20 mg·L-1氟啶酮、100 mg·L-12,3,5- 三碘苯甲酸（TIBA）和1000 mg·L-1多效唑于2022年2月26日采集当天对冬芽进行涂抹（0 d），共计6种处理，以清水涂抹作对照。将枝条插在沙子中，定期浇水使水位保持稍没过沙子。于25 ℃长日照（16 h/8 h）光照培养箱中培养，观察萌芽率，每6 d观察冬芽发育情况。采集激素处理后0、6、12、18 d的冬芽，沿冬芽四周将枝干和多余组织剪除，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3 萌芽率调查及冬芽萌发过程观察

以冬芽鳞片开裂，露出清晰可见的绿色组织视为芽萌发，萌芽率以百分比计算。

每组随机选择3～4个激素处理后0、6、12 d的单芽插条（因18 d芽已萌发到幼叶出现期，故未观察）。使用体视镜（徕卡显微系统有限公司、M205FCA型号）观察冬芽正视图和侧视图，手动切片后观察冬芽横切面和纵切面的结构变化。

1.4 生理数据

使用中通量组织研磨仪（北京鼎昊源科技有限公司，TL-2010S）液氮粉碎样品。每个处理组的冬芽样品设3个生物学重复。正式测定之前选择2～3个预期差异大的样品做预测定。18 d的样本已萌发为新梢，因此未曾检测相关生理指标，仅用于统计萌芽率。

过氧化氢、超氧阴离子、超氧化物歧化酶、丙二醛、植物淀粉、果糖、植物可溶性糖和双缩脲法蛋白质含量测定用试剂盒均购于苏州科铭生物技术有限公司，检测步骤及数值计算方法参考试剂盒说明书。

1.5 数据处理

每项生理指标的测定设3个生物学重复。使用Excel进行数据整理和绘图，使用SPSS进行差异显著性分析。聚类分析利用联川生物云平台（https://www.omicstudio.cn/tool）完成。

2 结果与分析

2.1 外源植物激素对葡萄冬芽萌芽率的影响

统计不同激素处理下葡萄冬芽的萌芽率（图1）。与对照相比，TIBA促进萌芽，多效唑、氟啶酮和ICA的萌芽率与对照基本一致，ABA、GA7抑制冬芽萌发。18 d时萌芽率除GA7处理组（63. 93%）外均超过90%。

2.2 体视镜观察冬芽萌发过程

如图2所示，在体视镜下观察不同时期的葡萄冬芽的发育状况。0 d时，各组冬芽芽鳞闭合，呈棕黄色，鳞片内绒毛排列紧实且厚。6 d时，冬芽开始膨大，芽鳞依旧闭合，但是从冬芽的纵切面来看，芽轴开始伸长并向四周生长，对照组、TIBA、多效唑和氟啶酮处理组冬芽顶端绒毛露出。12 d时，芽鳞破开，冬芽顶端黄色绒毛清晰可见，除ICA、GA7、ABA和氟啶酮处理组仍然看不到冬芽的绿色组织破出鳞片之外，对照组、TIBA和多效唑处理组已可见绿色组织，包被冬芽的绒毛被撑破，切面节间长度增加。其中GA7处理组冬芽结构变化最小，TIBA处理组冬芽萌发最旺盛。

2.3 葡萄冬芽萌发过程中各生理指标的变化

2.3.1 过氧化氢和超氧阴离子含量变化情况

H2O2和OFR是生物体内最常见的活性氧分子。随着葡萄冬芽发育H2O2含量先降低后升高（图3）。各激素处理下H2O2含量6 d时差异不显著；12 d时激素处理组TIBA、多效唑的H2O2含量偏高，而ICA、氟啶酮、ABA处理后H2O2含量升高较缓，GA7处理下H2O2含量偏低。

随着葡萄冬芽的发育，对照组OFR含量先升高后降低，ICA和TIBA处理组的OFR含量下降，GA7、ABA和氟啶酮处理组的OFR含量先降低后升高，多效唑处理组的OFR含量几乎不变（图3）。6 d时，处理组的OFR含量都显著低于对照组；12 d时，除了TIBA处理组外，其他处理组的OFR含量都显著高于对照组。

2.3.2 SOD酶活性和MDA含量的变化

SOD可以在生物体内催化超氧阴离子自由基生成氧和过氧化氢，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。检测冬芽萌芽期间SOD酶活性，发现其含量随芽的发育而逐渐上升（图4）。与对照相比，6 d时各激素处理下酶活性差异不显著，ABA处理下酶活性低于对照，其余处理酶活性高于对照；12 d时，多效唑和氟啶酮处理下的冬芽酶活性显著高于对照，GA7显著低于对照，其余激素处理下酶活性差异不显著。相对应的，GA7与ABA处理均显著降低芽的萌发率（图1）。

MDA是膜脂过氧化的重要产物之一，通过检测MDA水平即可检测脂质氧化的水平。随着冬芽的发育，MDA含量整体呈下降趋势，但下降幅度不大，说明膜脂过氧化程度较低或清除MDA的能力较强。同时，12 d时ICA、GA7、ABA处理组的冬芽MDA含量分别小于TIBA、多效唑、氟啶酮处理组的冬芽，但各处理组MDA含量的差异不显著。

2.3.3 糖类物质与蛋白质含量的变化

随着冬芽的发育，植物淀粉含量在下降（图5），但氟啶酮处理在6 d时淀粉含量比0 d时高，之后淀粉含量下降。与对照组相比，所有激素组处理后的冬芽淀粉含量均高于对照组。

植物可溶性糖包括葡萄糖、果糖、蔗糖等，在休眠到萌芽期间，植物淀粉可以转化为可溶性糖，为植物生长提供可利用的能量。检测了果糖在休眠到萌芽期间的变化（图5），随着葡萄冬芽的发育，冬芽中的果糖含量先下降后上升。6 d时各组果糖含量达到最低值，各组含量果糖差别不显著；12 d时果糖含量升高，其中ABA处理组果糖含量最高，TIBA处理组果糖含量最低。随着葡萄冬芽的发育，冬芽中的植物可溶性糖含量呈下降趋势（图5）。12 d时各激素处理组植物可溶性糖含量都高于对照组。

可溶性蛋白含量可反映植物的代谢水平，葡萄冬芽的可溶性蛋白质含量如图5所示。各组冬芽可溶性蛋白质含量总趋势表现为先下降后上升，其中在6 d时含量最低，随着休眠的结束，可溶性蛋白含量升高。6 d时ABA处理组可溶性蛋白含量低于对照组，12 d时ABA和氟啶酮处理组蛋白含量低于对照组，其余处理蛋白含量均高于对照组。

2.3.4 聚类分析

不同激素处理组以12 d的8种生理指标进行层次聚类分析表明（图6），ICA处理组的生理指标成分含量与CK接近；多效唑与氟啶酮处理组可聚为一类；GA7处理组与其他处理组成分含量有较大差异。

3 结论与讨论

葡萄冬芽的萌发是一个渐进的过程，通过观察各处理组冬芽的外部特征和内部结构特征变化，可以判断冬芽发育情况。在试验中，TIBA处理组冬芽的萌芽率高，多效唑、氟啶酮和ICA处理组的萌芽率与对照组基本一致，ABA和GA7处理组萌芽率低于对照组，且GA7处理组萌芽率最低。体视镜观察发现，TIBA处理组冬芽结构变化最大，萌发旺盛，而GA7处理组冬芽结构变化最小，内部生长缓慢，各结构虽发育但未成形。

葡萄冬芽内的生理指标变化与冬芽休眠的促进和解除有关，该类指标可在一定程度上表征葡萄冬芽的休眠进程。植物组织在自然休眠和休眠解除过程中的活性氧主要有H2O2和OFR等，抗氧化酶主要有SOD。试验中冬芽萌发时，TIBA处理提高了H2O2含量，GA7处理降低了H2O2含量。TIBA处理使OFR含量显著降低，其余处理OFR含量显著升高。冬芽的发育使植物体中产生并积累了活性氧，SOD酶活性呈上升趋势，以保护膜质过氧化损害细胞。GA7处理显著降低了SOD酶活性，而其余处理组SOD酶活性升高。MDA含量反映了植物体脂质过氧化的程度。葡萄冬芽MDA含量呈下降趋势，说明植物体内膜脂过氧化程度减小。

糖类物质在植物体内既是碳源，也是能量的主要来源，也可作为影响芽生长的信号分子[16]。因此，可以从碳水化合物变化的角度来描述休眠释放和芽萌发过程。葡萄冬芽在休眠解除的过程中，淀粉含量下降，这与郑鹏华[17]的研究结果一致。与对照相比，6种激素处理均提高了冬芽的淀粉含量，其中GA7处理组淀粉含量显著增加。果糖含量先下降后上升，其中ABA处理组果糖含量最高，这与Khalil-Ur-Rehman等[18]的研究结果一致；TIBA和GA7处理降低了果糖含量。孙凌俊等[19]发现，‘巨峰’葡萄枝条的可溶性糖含量在休眠解除过程中逐渐降低。本试验中冬芽可溶性糖含量随着休眠的解除而下降，可溶性糖的快速消耗，表明芽的代谢活性已经增强，6种激素处理均可提高冬芽的可溶性糖含量。试验中可溶性蛋白质含量呈现出先降低再升高的过程，前期的降低可为冬芽打破休眠开始萌发做物质准备，随着休眠的解除，可溶性蛋白积累以满足冬芽萌发的营养需求。试验中ABA和氟啶酮处理组可溶性蛋白含量降低，其余处理组可溶性蛋白含量增加。

植物激素是调控植物芽休眠过程的重要内部因素。TIBA通过与生长素结合受体抑制生长素的极性运输，以降低生长素的作用效力，是一种具有微弱生长素作用的抗生长素。本研究中，外源TIBA处理提高了葡萄冬芽的萌芽率，冬芽内部结构变化大，冬芽中H2O2含量上升，超氧阴离子含量降低，SOD酶活性升高，植物淀粉含量升高，果糖含量下降，说明在葡萄冬芽生长发育过程中，外源TIBA处理可以促进葡萄冬芽的生长和发育。但外源ICA处理对冬芽休眠的解除没有显著影响。GA7在葡萄冬芽上的作用则与TIBA正好相反，GA7处理下葡萄冬芽萌芽率降低，冬芽内部结构特征变化小，H2O2含量显著低于其他处理组，超氧阴离子含量上升，SOD酶活性降低。岳海英等[20]在‘红地球’葡萄上施用赤霉素未发现有促进冬芽萌发的作用。Zheng等[11]推测赤霉素在葡萄上的作用是促进芽萌发后的生长发育，但对萌芽前休眠的打破存在负面效应。

以上结果表明，葡萄冬芽萌发过程中其活性氧、保护酶活性和营养物质的变化具有一定的规律性。植物激素参与调控‘赤霞珠’葡萄冬芽的萌发，其中，TIBA处理促进葡萄冬芽的萌发，而GA7处理对冬芽的萌发表现出抑制作用。