养阴清热方通过下调JAK/STAT信号通路调节Treg/Th17平衡的实验研究

掌琳惠,马元婧,缪蓉,王伟,翁文馨,袁冬平,龙军,孙云霞

(1.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023;2.江苏省中医院老年科,江苏 南京 210004)

动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是心血管疾病的先发事件,是一种以血管壁脂质沉积为特点的慢性炎症性自身免疫疾病[1]。诱发AS的因素很多,细菌感染机体后释放的LPS可以促进AS的发展。LPS可以促进CD4+T细胞向辅助性T细胞17(Helper T cells 17,Th17)亚群分化,减少调节性T细胞(Regulatory T cells,Treg)亚群的比例。在LPS作用下,机体呈现出抗炎细胞因子(如IL-10、TGF-β等)少、促炎细胞因子(如IL-6、IL-12p70等)多的炎症状态[2-3]。现已知Treg/Th17平衡是调控AS免疫炎症的关键,转录因子Foxp3和RORγt分别是调节Treg和Th17的关键因子[4-5]。

养阴清热方(YHF)是全国名老中医唐蜀华教授治疗AS的经验方,在临床上已应用多年。课题组前期研究发现YHF可以调节外周Treg/Th17的平衡,改善高脂饮食诱导的ApoE-/-小鼠AS症状[6-7],然而具体机制仍不明确。酪氨酸蛋白激酶/信号转导子和转录激活子(JAK/STAT)通路是多种细胞因子信号转导的共同通路,参与炎症的发生发展。研究表明,IL-6介导的JAK/STAT信号通路在初始CD4+T细胞分化中起重要作用[8],细胞因子IL-6的释放促进了CD4+T细胞分化为Th17和Treg[9]。因此,JAK/STAT通路在Treg/Th17平衡中发挥重要的作用。本实验着重观察YHF对LPS刺激下的小鼠CD4+T细胞Treg/Th17平衡及炎性细胞因子表达的影响,并探讨这一过程是否与JAK/STAT信号通路有关。

1 材料

1.1 细胞

1.2 药品与试剂

标准品:虎杖苷、白藜芦醇、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷、大黄素、羟基红花黄色素A、姜黄素、芦丁、槲皮素(上海源叶生物科技有限公司,HPLC≥98%,批号:T15A10F85743、R19J12S138196、J17N8Z48440、T17A10F95418、C10J9Q52616、HA0820KA14、Y24F11Y7051、YJ0603HA13)。PBS(武汉博士德生物工程有限公司,批号:09D16B30);RPMI培养基(Hyclone,批号:319075016);胎牛血清(Gibco,批号:1205331);二甲基亚砜(南京化学试剂有限公司,批号:14081511779);LPS(Tocris,批号:1158);小鼠Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells试剂盒(Invitrogen,批号:11416D);MTT(Biosharp,批号:0793);AG490(Sigma,批号:658411);Leukocyte Activation Cocktail(BD Pharmingen,批号:9324126);FITC Rat IgG2a K Isotype对照流式抗体、PE Mouse IgG2a K Isotype对照流式抗体、APC Arm Hamster IgG2a K Isotype对照流式抗体(eBioscience,批号:E00569-1633、4281861、4283465);4×细胞固定破膜缓冲液、5×细胞破膜/洗涤缓冲液(BD Pharmingen,批号:1285830、8229785);抗小鼠CD4 FITC流式抗体(Invitrogen,1984820);抗小鼠CD25 PE流式抗体、抗小鼠IL-17A PE流式抗体(eBioscience,批号:4277529、4306479)、抗小鼠Foxp3 APC流式抗体(BD Pharmingen,批号:5006762);Foxp3兔抗鼠多克隆抗体(Proteintech,批号:01581000);STAT3兔抗鼠多克隆抗体、JAK2兔抗鼠多克隆抗体、RORγt兔抗鼠多克隆抗体、p-STAT3兔抗鼠多克隆抗体、p-JAK2兔抗鼠多克隆抗体(Abcam,批号:GR186186855-6、GR317162-2、GR316144-3、GR287047-19、GR3174887-5);小鼠IL-6、TGF-β、IL-10、IL-12p70 ELISA试剂盒(杭州联科生物技术股份有限公司,批号:EK2061/2、EK2812/2、EK210/3-96、EK212HS-96)。

1.3 仪器

低温冷却液循环泵(南京金正公司,型号:DLSB-5L/20);高效液相色谱仪(美国Thermo Scientific公司,型号:UltimateTM3000);酶标仪(瑞士TECAN公司,型号:Infinite M200PRO);流式细胞仪(美国BD公司,型号:GaliosTMFlow Cytometer);电泳仪(美国Bio-Rad公司,型号:164-5050Western);凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司,型号:GelDoc2000)。

2 方法

2.1 YHF水提液的制备

药材制何首乌、酒黄精、虎杖、漏芦、姜黄、红花均购自江苏省中医院,并经南京中医药大学刘圣金教授鉴定均为正品,以1∶1∶3∶3∶1∶1的质量比混合,于8倍体积蒸馏水中浸泡1 h,随后煎煮1 h,收集水煎液。药渣再用6倍水煎煮1 h,合并2次煎液。将所得水煎液于旋转蒸发仪蒸发浓缩,旋蒸温度为60 ℃，得YHF水提液(2 g·mL-1),分装冻存于-20 ℃冰箱,备用。

2.2 HPLC检测

检测前先解冻YHF水提液,12 000 r·min-1离心5 min,移取上清,三蒸水稀释20倍,0.45 μm微孔滤膜过滤。色谱柱:Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流动相:0.2%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)。梯度洗脱条件:0～25 min:90%A;25～35 min:82%A;35～45 min:60%A;45～50 min:40%A。流速:1.0 mL·min-1。柱温:30 ℃。进样量:10 μL。检测波长:羟基红花黄色素A,407 nm;虎杖苷,320 nm;芦丁,350 nm;2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷,320 nm;白藜芦醇,320 nm;槲皮素,365 nm;大黄素,254 nm;姜黄素,375 nm。将样品与标准品保留时间进行比对,对色谱峰进行定性分析,通过外标法计算样品中有效成分含量。

2.3 脾脏CD4+ T细胞的分选

无菌分离小鼠完整脾脏,研磨成细胞匀浆,过滤,加入红细胞裂解液混匀,静置,离心收集细胞。参照小鼠Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells试剂盒说明书用法,磁珠分选出CD4+T细胞。加入抗CD3/CD28抗体(4 μg·mL-1抗小鼠CD28抗体和6 μg·mL-1抗小鼠CD3抗体),于37 ℃,5%CO2条件下培养分离得到的CD4+T细胞[7]。

2.4 分组与给药

LPS浓度筛选试验分组:空白对照组和LPS组。用完全培养基调整细胞浓度为1×106mL-1,接种到96孔板中。空白对照组给予抗CD3/CD28抗体。LPS组在抗CD3/CD28抗体的基础上给予LPS,分为0.001、0.01、0.1、1、10、100 μmol·L-16个浓度组。每组设置6个复孔。细胞培养箱继续孵育12 h,MTT法分别检测各孔在490 nm波长处的OD值。

给药浓度筛选实验分组:空白对照组，LPS组，1、2、4、8 mg·mL-1YHF组。各组细胞均用完全培养基调整细胞浓度为1×106mL-1,接种到96孔板中,给予抗CD3/CD28抗体孵育培养。每组设置6个复孔。空白对照组给予等体积的RPMI无血清培养基。LPS组给予0.1 μmol·L-1LPS培养12 h。YHF组在给予LPS培养12 h后分别给予不同浓度的YHF(1、2、4、8 mg·mL-1)。24 h和48 h后MTT法分别检测各孔在490 nm波长处的OD值。

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在研究YHF对JAK/STAT信号通路影响的实验中使用JAK抑制剂AG490。AG490配制成5 mmol·L-1的母液,用时以终浓度为50 μmol·L-1加入到CD4+T细胞中。YHF的浓度为4 mg·mL-1。YHF作用于CD4+T细胞24 h后做相应检测。

2.5 ELISA法检测细胞培养上清细胞因子含量

CD4+T细胞培养24 h后,3 000 r·min-1离心10 min,收集上清液。使用ELISA试剂盒检测上清液中IL-10、TGF-β、IL-6和IL-12p70含量。样本上样量100 μL。按照说明书步骤,依次加入待检样本、抗体、HRP显色底物、终止液进行孵育、洗涤,最后用酶标仪读取指定波长下的OD值,按说明书中的计算公式,计算细胞因子含量。

2.6 流式细胞术检测CD4+ T细胞中Treg、Th17细胞的比例

在给药18 h后将细胞用含1%BSA的PBS清洗并用Leukocyte Activation Cocktail处理6 h,然后将细胞与流式抗体在4 ℃条件下避光孵育。荧光标记Foxp3或IL-17A前先在细胞中加入固定/破膜液对细胞打孔,然后加入Foxp3或IL-17A流式抗体孵育标记。加入染色缓冲液清洗,再将细胞重悬于染色缓冲液中,上机检测。首先在FSC-SSC散点图中将淋巴细胞群设门,根据标记的CD4流式抗体圈出CD4+T细胞。然后根据CD25流式抗体和Foxp3抗体圈出CD25+Foxp3+T细胞(Treg细胞),或者根据IL-17A流式抗体圈出IL-17A+T细胞(Th17细胞),即可得到这些细胞占CD4+T细胞的比例。

2.7 Western blot法检测蛋白的表达

用RIPA强裂解液提取细胞蛋白,再用BCA法测定蛋白质量浓度。加入上样缓冲液,在100 ℃金属浴中变性10 min。将30 μg蛋白样品加入10%SDS-PAGE凝胶中进行电泳。电泳结束后,将蛋白转移到PVDF膜上。抗体孵育前,使用溶于TBST(含0.1%聚山梨酯20的三乙醇胺缓冲盐溶液)的脱脂奶粉封闭。封闭结束后,根据蛋白质的相对分子质量裁剪PVDF膜,并先后在稀释于5%BSA溶液的一抗和含HRP的二抗中孵育。孵育结束后,PVDF膜用TBST漂洗,滴加适量化学发光HRP底物,在全自动凝胶成像仪中获取条带图像,并用Image Lab4.0.1软件(Bio-rad公司)分析。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 YHF水提液的有效成分分析

在YHF水提液中共鉴定出8种有效成分,分别为羟基红花黄色素A、虎杖苷、芦丁、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷、白藜芦醇、槲皮素、大黄素、姜黄素,各成分的含量见表1,色谱峰见图1。

表1 YHP水提液中8种有效成分含量

注: A.407 nm;B.320 nm;C.350 nm;D.320 nm;E.320 nm;F.365 nm;G.254 nm;H.375 nm;1.红花黄色素;2.虎杖苷;3.芦丁;4.2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷;5.白藜芦醇;6.槲皮素;7.大黄素;8.姜黄素

3.2 YHF对LPS诱导的CD4+ T细胞增殖的抑制作用

MTT结果见图2A,相较于空白对照组(CD3/CD28),0.01～10 μmol·L-1LPS作用CD4+T细胞12 h后,可显著促进细胞增殖(P<0.01，P<0.001),其中0.1 μmol·L-1的作用更明显(P<0.001)。因此,后续研究选择0.1 μmol·L-1LPS与CD4+T细胞作用12 h作为刺激CD4+T细胞增殖的条件。

为了观察YHF对LPS刺激的CD4+T细胞增殖是否有干预作用,本实验用MTT法检测了LPS刺激CD4+T细胞12 h后,YHF干预24 h和48 h对细胞活力的影响，结果见图2B。1、2、4、8 mg·mL-1YHF作用CD4+T细胞24 h,均可以抑制LPS诱导的细胞增殖(P<0.05);2、4 mg·mL-1YHF作用CD4+T细胞48 h,可以抑制LPS诱导的细胞增殖(P<0.05)。由于YHF作用细胞48 h的平均细胞活力低于24 h,因此选用YHF给药浓度为1、2、4 mg·mL-1和给药时间为24 h作为后续实验条件。以上结果提示,YHF水提液可以抑制LPS诱导的CD4+T细胞增殖。

注:与空白对照组(CD3/CD28)比较,**P<0.01,***P<0.001;与LPS组比较,

3.3 YHF对CD4+ T细胞中Treg、Th17比例的影响

检测CD4+T细胞中Treg、Th17比例的结果见图3,与空白对照组比较,0.1 μmol·L-1LPS作用CD4+T细胞12 h后,Treg比例减少(P<0.05),Th17比例明显增加(P<0.01)。与LPS组比较,1、2、4 mg·mL-1的YHF作用细胞24 h后,Treg细胞比例均升高(P<0.05,P<0.01),Th17细胞比例降低(P<0.01)。以上结果提示,YHF能影响LPS刺激下的CD4+T细胞中Treg/Th17比例,使Treg/Th17比例向Treg方向偏移。

注:与空白对照组(CD3/CD28)比较,*P<0.05,**P<0.01;与LPS组比较,

3.4 YHF对CD4+ T细胞上清中Treg、Th17相关的细胞因子表达的影响

ELISA法检测细胞上清中Treg(IL-10、TGF-β)和Th17(IL-6、IL-12p70)相关细胞因子的含量,结果见图4。与空白对照组比较,0.1 μmol·L-1LPS作用CD4+T细胞12 h后,Treg相关的IL-10和TGF-β含量减少,Th17相关的IL-6、IL-12p70含量增加(P<0.05)。与LPS组比较,2 mg·mL-1YHF增加TGF-β、IL-10的含量(P<0.05)，降低IL-6的含量(P<0.05),4 mg·mL-1YHF可显著增加TGF-β的含量(P<0.05)，减少IL-6、IL-12p70的含量(P<0.05)。以上结果表明,在LPS刺激CD4+T细胞的情况下,使用YHF进行干预可以促进抗炎因子IL-10、TGF-β的分泌,抑制炎性因子IL-6、IL-12p70的分泌。

注:与空白对照组(CD3/CD28)比较,*P<0.05;与LPS组比较,

3.5 YHF对CD4+ T细胞中Treg、Th17特征性转录因子Foxp3和RORγt蛋白表达的影响

Western blot结果显示,与空白对照组比较,0.1 μmol·L-1LPS作用CD4+T细胞12 h后,Treg转录因子Foxp3的表达减少,Th17转录因子RORγt增加(P<0.05)。与LPS组比较,2、4 mg·mL-1YHF均能增加Foxp3蛋白的表达(P<0.05),减少RORγt蛋白的表达(P<0.01,P<0.05),结果见图5。

注:与空白对照组(CD3/CD28)比较,*P<0.05;与LPS组比较,

3.6 YHF通过JAK/STAT信号通路干预Treg和Th17相关转录因子的表达

Western blot结果显示,与空白对照组比较,0.1 μmol·L-1LPS能显著增加JAK2和STAT3蛋白的表达(P<0.01)。与LPS组比较,1、2、4 mg·mL-1YHF能够降低JAK2蛋白表达(P<0.05,P<0.01)和STAT3蛋白表达(P<0.05),结果见图6。

注:与空白对照组(CD3/CD28)比较,**P<0.01;与LPS组比较,

AG490是一种酪氨酸激酶受体抑制剂,可作为JAK抑制剂特异性抑制STAT3的磷酸化和活性[10]。与LPS组比较,CD4+T细胞经4 mg·mL-1YHF处理24 h后,p-JAK2、p-STAT3和RORγt蛋白的表达量均下降(P<0.05),Foxp3蛋白表达增加(P<0.05)。与LPS组比较,CD4+T细胞经AG490处理24 h后,p-JAK2、p-STAT3和RORγt蛋白的表达量均下降(P<0.01，P<0.001),Foxp3蛋白表达增加(P<0.01)。与YHF组比较,YHF与JAK2特异性抑制剂AG490联合使用可显著降低p-JAK2、p-STAT3和RORγt蛋白表达(P<0.01),增加Foxp3蛋白表达(P<0.01)。见图7。以上结果表明YHF可以下调p-JAK2、p-STAT3和RORγt蛋白的表达,增加Foxp3蛋白表达。

注:与空白对照组(CD3/CD28)比较,*P<0.05,**P<0.01;与LPS组比较,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;与YHF组比较,

3.7 YHF通过JAK/STAT信号通路干预CD4+ T细胞上清中Treg、Th17相关细胞因子的表达

ELISA实验结果见图8,与LPS组比较,4 mg·mL-1YHF促进抗炎因子IL-10、TGF-β的分泌(P<0.05),抑制炎性因子IL-6、IL-12p70的分泌(P<0.05),这与JAK2特异性抑制剂AG490的作用趋势一致。YHF与AG490联合使用促进抗炎因子IL-10、TGF-β的分泌(P<0.05，P<0.01),抑制炎性因子IL-6、IL-12p70的分泌(P<0.05)。

注:与空白对照组(CD3/CD28)比较,*P<0.05;与LPS组比较,

4 讨论

在中医理论中,AS属“胸痹”“真心痛”等范畴,主要病机归为虚-痰-瘀-毒[11]。针对AS阴虚、痰湿致体生瘀热、毒邪的病理特点,YHF以养阴、清热、活血、解毒为治则组方,缓解AS进程。近年来AS的免疫炎症学说认为,在AS发展过程中,巨噬细胞[12]、树突状细胞[13]以及T细胞[14]存在数量和功能上的紊乱。Treg和Th17是调节免疫炎症的关键T细胞亚群,Treg具有免疫抑制作用而Th17细胞可以促进炎症发展。因此调节Treg与Th17之间的平衡被认为是调控AS免疫炎症的关键[4,15]。

课题组前期研究已证实,YHF能够调节AS小鼠外周血Treg水平,改善体内Treg/Th17平衡[16]。在本研究中,我们进一步观察到YHF能够抑制LPS刺激的CD4+T细胞增殖,并使Treg/Th17平衡向Treg方向偏移。此外,YHF对Treg/Th17特征性转录因子Foxp3/RORγt的表达也产生了相应的调节作用。这些结果说明调节Treg/Th17平衡是YHF改善AS的机制之一。

JAK2/STAT3是JAK/STAT信号通路的重要成员,具有促进炎症的作用并在AS中发挥着重要作用[17-18]。在STAT中,STAT3蛋白是初始T细胞分化为Treg或炎症性Th17细胞的重要决定因素,STAT3的磷酸化能够促进RORγt的合成[9]。本实验检测了CD4+T细胞JAK2、STAT3蛋白的表达情况,结果显示,YHF可以减少CD4+T细胞中JAK2、STAT3蛋白的表达,与JAK2特异性抑制剂AG490[19]的联用进一步证实了YHF可以作用于CD4+T细胞中的JAK2。以上结果表明,YHF调节Treg/Th17平衡的作用可能是通过JAK2/STAT3信号通路实现的。

本实验通过HPLC检测发现YHF水提液中存在8种有效成分,分别为羟基红花黄色素A、虎杖苷、芦丁、2,3,5,4'-四羟基二苯乙烯葡萄糖苷、白藜芦醇、槲皮素、大黄素和姜黄素。据报道：羟基红花黄色素A可通过Toll样受体8(TLR8)信号调节卵巢癌CD4+T细胞极化和免疫细胞因子的表达[20]；虎杖苷可以降低ApoE-/-小鼠血清中炎性细胞因子和趋化因子的含量,对AS有一定的预防和缓解作用[21]；槲皮素可以通过下调高迁移率族蛋白1(HMGB1)和Toll样受体4(TLR4)的蛋白和基因表达,产生抗AS的作用[22]；大黄素能抑制JAK2/STAT3信号通路,延缓ApoE-/-小鼠AS斑块的形成[23]；姜黄素能抑制TLR4的表达及其相关的炎症反应,产生抗AS的作用[24]。前期研究发现,白藜芦醇可以抑制T细胞的活化并减轻高脂饮食伴随LPS刺激诱发的AS[25]。因此,本研究中观察到YHF调节Treg/Th17平衡的作用与这些成分的抗炎和免疫调节作用有密切关系。

综上所述,本研究发现YHF可以有效抑制LPS诱导的小鼠CD4+T细胞增殖,抑制JAK2/STAT3信号分子的表达,增加Foxp3的表达和减少RORγt的表达,同时增加抗炎细胞因子IL-10和TGF-β的分泌,抑制促炎细胞因子IL-6和IL-12p70的分泌。YHF通过以上作用实现了对AS免疫炎症的调控。