低氧暴露下高原鼠兔肺组织间隙连接蛋白40表达分析

张湑泽 付林 邹小艳 都玉蓉

(1 青海民族大学生态环境与资源学院，国家民委青藏高原资源化学与生态环境保护重点实验室，西宁810007)(2 云南大学生命科学学院，昆明650091)(3 长沙医学院药学院，长沙410219)(4 青海师范大学生命科学学院，青海省青藏高原生物多样性形成机制与综合利用重点实验室，西宁810008)(5 中国科学院西北高原生物研究所，中国科学院高原生物适应与进化重点实验室，西宁 810001)

低氧性肺血管收缩(Hypoxia pulmonary vasoconstriction,HPV)反应是指在高海拔或常压低氧条件刺激下，哺乳动物肺动脉血管阻力增强，肺动脉压升高的生理现象(Voelkelet al.,2013)。长期低氧可使平原动物血管形态发生改变，主要表现为肺小动脉中层肥厚，无肌型肺小动脉出现平滑肌层，血管结构重构，出现肺动脉高压。低氧性肺血管收缩反应钝化(Blunted hypoxic pulmonary vasoconstriction,bHPV) 是在长期缺氧环境下，哺乳动物肺小动脉血管收缩反应明显钝化，使其能适应低氧环境的生理现象。

高原鼠兔(Ochotona curzoniae) 属兔形目(Lagomorpha) 鼠兔科(Ochotonidae) 鼠兔属，是一种小型非冬眠植食性哺乳动物，主要分布于青藏高原及其边缘地带，栖息在海拔3 000～ 5 000 m的高寒草甸和灌丛(冯祚建和郑昌琳，1985)。高原鼠兔通过降低血液血红蛋白含量，增强氧利用率，肺血管收缩反应钝化等生理反应适应高海拔低氧环境(Geet al.,1998;Sheafor,2003；王晓君等，2008)。研究发现高原鼠兔具有低氧胁迫下bHPV、低氧性肺血管重构发生等典型生理和组织形态特征(Zhaoet al.2004;Liet al.,2009)，与平原动物在低氧暴露时发生HPV 或肺动脉高压明显不同。因此，该动物被认为是研究高海拔低氧适应的最佳动物模型(杜继曾和李庆芬，1982；吴雁和杜继曾，2001)。

间隙连接(Gap Junction,GJ) 广泛存在于动物组织中，是相邻细胞间直接的细胞通讯方式(Kumar and Gilula,1996)，在动脉血管各细胞层都有分布，参与调解血管收缩和舒张，是小动脉平滑肌细胞间进行物质交换的通道(Hervé and Derangeon,2013)。间隙连接蛋白40 (Connexin40,Cx40) 是血管内皮细胞表达的连接蛋白(Gabriels and Paul,1998;Severset al.,2001;Leybaertet al.,2017)，通过调节内皮细胞信号转导，参与低氧性肺血管收缩反应，在动脉血管发育、内皮依赖型血管舒张传导、血管壁和心肌细胞电偶联等生理过程中发挥着重要作用(Bruzzoneet al.,1993;Witet al.,2000;Simonet al.,2004;Wölfleet al.,2007)。慢性缺氧诱导小鼠肺内皮细胞Cx40蛋白表达水平降低，使内皮依赖型肺血管舒张导致肺动脉高压(翟鹏和尹俊，2016;Siet al.,2020)。鉴于Cx40 在模式动物血管发育调节中的关键作用及高原鼠兔对高原低氧的特殊适应机制，我们推测Cx40 在高原鼠兔低氧适应中具有重要作用。探明Cx40 表达特征对进一步理解Cx40 在高原鼠兔bHPV 反应中的作用机制具有重要价值。本研究拟对低氧暴露前后高原鼠兔肺组织中Cx40 表达位点进行定位，检测Cx40 表达量，分析其在高原鼠兔低氧适应中的作用。对Cx40 表达模式的解析可为高原鼠兔肺组织低氧相关基因表达分析提供参考依据。

1 研究方法

1.1 高原鼠兔样品采集及处理

2017年6月，在青海海北高寒草地生态系统国家野外科学观测研究站(北纬37°36′07.93″，东经101°18′09.03″，海拔3 217 m) 附近，捕捉成年健康高原鼠兔20 只，体重均为100～ 150 g，随机分为对照组和低氧处理组，每组各6 只，雌雄各半。高原鼠兔对照组在海北站动物实验室(海拔3 200 m)饲养4周，低氧组在低压氧舱中，模拟海拔5 000 m，处理4 周。SD 大鼠购于陕西省西安市，共20 只，带回西宁后于SPF 洁净室静养4 周，选体重250～300 g 个体随机分为对照组和低氧处理组，每组各6 只，雌雄各半。SD 大鼠对照组在中国科学院西北高原生物研究所动物实验室(海拔2 200 m)继续饲养4 周，低氧组在模拟海拔5 000 m 低压氧舱中处理4 周。低氧处理实验在青海大学高原医学研究中心的低压氧舱中进行(模拟海拔5 000 m，空气氧含量为12.95%)。完成处理后，各组实验动物用2.5%戊巴比妥钠以0.2 mL/100 g 体重进行轻微麻醉，测定生理指标后断颈处死。取高原鼠兔和SD 大鼠部分肺组织，冷冻于液氮，置-70℃低温冰箱保存备用；部分肺组织用4%多聚甲醛固定备用。动物实验均严格按照中国科学院西北高原生物研究所动物伦理委员会规定执行。

1.2 高原鼠兔Cx40基因mRNA定量分析

提取低氧处理前后高原鼠兔肺组织RNA，根据高原鼠兔Cx40基因序列(转录组测序数据，基迪奥生物，广州)，采用Primer 5.0 软件设计Cx40基因引物序列，以GAPDH为内参，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。GAPDH引物序列为 F：TCACCACCATGGAGAAGGC；R：GCCAAGCAGTTGGTGGTGCA，扩增长度为169 bp。Cx40引物序列为F：ATCGGCAAGGTCTGGCTCAC；R：CGGCGTGGAGACGAAGATG，扩增长度为204 bp。qRT-PCR测定低氧处理前后高原鼠兔Cx40基因mRNA表达量。

1.3 高原鼠兔Cx40蛋白定量分析及免疫组化

对低氧处理前后高原鼠兔和SD 大鼠肺组织进行石蜡切片，免疫组化染色，Western blotting 分析蛋白表达。肺组织在4℃用4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，将包埋样本切成4.5 μm厚的切片。切片用Cx40(GJα5)抗体(3%牛血清白蛋白稀释1∶100;BA1593-1) 孵育，4℃过夜，辣根过氧化物酶偶联(HRP)-山羊抗兔二抗(1∶500;RS 0002)在室温孵育2 h，进行免疫组化染色，用徕卡DMR 相机进行10 × 和40 ×拍照。

使用Bradford 蛋白测定试剂盒(碧云天生物，北京)测定肺总蛋白浓度。用15%SDS PAGE 凝胶电泳分离40 μg 的肺组织总蛋白，将分离的蛋白转移到PVDF 膜，在Tris-Tween-20 生理盐水缓冲液中用3% BSA 封闭过夜，用Cx40 (GJα5)抗体孵育PVDF 膜(用5% 的脱脂奶粉稀释1∶500;BA1593-1)，4℃过夜，再用HRP-山羊抗兔二抗(1∶500)和β-actin 单克隆抗体(1∶500;RLM 3028) 孵育，用HRP-山羊抗小鼠IgG 抗体(1∶500 杂交)，使用ECL 试剂盒(Beyotime,China) 开展底物发光反应，检测免疫反应信号，使用Bio-Rad Chemi-DocTM MP成像系统检测PVDF膜。使用ImageJ软件对蛋白条带进行灰度测定。每个样本进行3次重复实验。

1.4 数据处理

qPCR 实验结果采用2-ΔΔCT计算Cx40相对表达量，以GAPDH为基准进行校正。用ImageJ 软件测定Cx40 和β-Actin 条带灰度值。以Cx40 蛋白条带的灰度值与β-Actin 蛋白的灰度值的比值为标准化结果。以上所有数据均使用SPSS 20.0 软件处理，采用独立样本t检验分析，结果以平均值±标准误(mean±SE)表示。用Graphpad 8 进行数据统计作图。P＜0.05 表示差异显著，P＜0.01 表示差异极显著。

2 结果

2.1 高原鼠兔和SD 大鼠肺组织低氧后Cx40 蛋白的免疫组化分析

低氧处理后，高原鼠兔肺组织形态结构未出现明显变化，肺泡呈空囊泡状，平均肺动脉压和右心指数无显著性变化，SD 大鼠平均肺动脉压和右心指数呈显著增高。对高原鼠兔及SD 大鼠肺组织切片进行免疫组化染色发现，Cx40 蛋白定位于肺组织血管和肺支气管。低氧处理后，高原鼠兔肺血管Cx40 蛋白减少，肺支气管Cx40蛋白无明显变化；SD 大鼠肺血管和支气管Cx40蛋白在低氧处理前后均无明显变化(图1)。

图1 低氧处理前后高原鼠兔和SD大鼠肺组织Cx40蛋白的免疫组化定位.A～B：SD大鼠肺组织切片；C～D：高原鼠兔肺组织切片；E～F：SD大鼠低氧处理后肺组织切片；G～H：高原鼠兔低氧处理后肺组织切片.图中红色箭头指向血管，蓝色箭头指向支气管Fig.1 Cx 40 localization in the lung tissues of plateau pika and SD Rat between hypoxia group and control group.A-B: refers lung tissue sections of SD rats;C -D: refers lung tissue sections of plateau pika;E -F: refers lung tissue sections of SD rats treated with hypoxia;G -H: refers lung tissue sections of plateau pika treated with hypoxia.The red arrow point to vascular,the blue arrow points to the bronchus.The red arrow point to vascular,the blue arrow points to the bronchus

2.2 低氧处理后高原鼠兔肺组织Cx40 基因mRNA表达量

qPCR 数据显示，高原鼠兔肺组织Cx40基因在低氧处理前后均有表达，低氧处理后，高原鼠兔Cx40基因mRNA 表达量呈显著升高(P=0.013)(图2)。

图2 高原鼠兔低氧处理前后Cx40 基因mRNA 表达量(n=6).mRNA定量以GAPDH为内参基因，结果以mean±SE表示，*表示显著差异(P ＜0.05)Fig.2 Cx40 mRNA expression level in plateau pikas treated with hypoxia (n=6). GAPDH was used as the reference gene for mRNA quantification,and the result was expressed by mean ± SE.* represents significant difference(P ＜0.05)

2.3 Cx40蛋白表达水平分析

Cx40蛋白水平分析结果显示，与对照组相比，高原鼠兔低氧处理组Cx40 蛋白水平显著降低(P=0.008)；低氧处理前后SD 大鼠Cx40蛋白水平无显著变化(P=0.984 3)(图3)。

图3 高原鼠兔和SD 大鼠在低氧处理前后Cx40 蛋白水平的变化(n=3).蛋白定量以β-actin 为内参，结果以mean±SE 表示.**表示极显著差异(P ＜0.01)，ns表示无显著差异Fig.3 Changes of Cx40 protein levels in plateau pika and SD rat under hypoxia treatment (n=3).β-actin was used as internal reference for protein quantification,and the results were expressed as mean ±SE;** represented extremely significant difference (P ＜0.01),while ns represented no significant difference

3 讨论

高原鼠兔在长期适应低氧过程中，部分形态特征和生理性状明显特化，如较恒定的肺动脉压、无右心室肥大、更低的缺氧血管收缩反应等(Geet al.,1998；王晓君等，2008)。高原鼠兔具有明显的bHPV 反应，其肺小动脉壁薄，维持较薄的中膜平滑肌层以降低肺血管阻力(王晓勤等，2001；陈秋生等，2006；李双等，2020)。而大鼠等平原动物在长期低氧环境中会形成以肺血管收缩反应增强，肺小动脉平滑肌细胞异常增生和中层平滑肌增厚为主的低氧性肺动脉高压(陈秋红，2001；马兰等，2007；张晶晶，2018；王睿等，2021)。研究表明，低氧处理后，高原鼠兔平均肺动脉压(mPAP)、右心指数(RV/LV)无明显变化，SD 大鼠平均肺动脉压明显升高，右心指数明显增大(付林，2018;Zhanget al.,2022)。肺动脉压基本稳定可避免高原鼠兔因右心室负荷加重，导致右心室肥厚甚至右心功能衰竭。本研究中，肺组织免疫组化结果表明，高原鼠兔和SD大鼠Cx40蛋白定位于肺支气管和肺血管壁，低氧处理后，高原鼠兔肺支气管Cx40蛋白无明显变化，肺血管Cx40蛋白明显减少，SD大鼠肺血管和肺支气管Cx40蛋白均无明显变化；qPCR结果显示，高原鼠兔Cx40基因mRNA 表达量呈显著上升，与高原鼠兔肺组织RNA-Seq分析结果一致(Zhanget al.,2022)；Western bloting结果显示，高原鼠兔肺组织Cx40蛋白在低氧处理后表达量下降，SD大鼠肺组织Cx40蛋白未表现出明显的表达量变化。以上结果表明，低氧处理后，高原鼠兔和SD大鼠Cx40蛋白表达水平不同。高原鼠兔通过肺血管Cx40 蛋白下调介导低氧性肺血管收缩反应，通过调节内皮细胞信号转导抑制血管收缩信号，减弱低氧性肺血管的收缩，使高原鼠兔肺动脉压和右心指数维持相对稳定(Wanget al.,2012；卓泓宇等，2014；潘立君等，2015)。

一氧化氮(NO) 可能是Cx40 蛋白参与低氧性肺血管收缩反应的重要调节因子。在哺乳动物体内，低氧诱导因子(Hypoxia-inducible transcription factors,HIFs)是肺动脉高压调控的关键因子(Zhaoet al.,2004)，参与肺血管重塑、细胞增殖和调控HPV 反应(Cowburnet al.,2016)。NO 是由一氧化氮合酶合成，在HIFs 调控下参与低氧应答和低氧性血管重构过程(Grilli,2003;Semenza,2005)。研究发现，抑制大鼠星形胶质细胞中一氧化氮合酶的表达，可降低间隙连接的渗透性(Bolanos and Medina,1996)，NO 也可通过cGMP-PKG 通路引起间隙连接蛋白磷酸化(Lu and Mcmahon,1997;Rudyket al.,2019)，暗示NO 或能调控间隙连接蛋白功能。NO 是高原鼠兔体内最重要的血管舒张因子之一，通过抑制平滑肌细胞的增殖，舒张肺血管(汪涛等，2004)，其含量随着高原鼠兔所处环境氧分压的升高而降低(Xieet al.,2014)。因此，我们推测NO-Cx40 作用于高原鼠兔肺血管，引起平滑肌细胞舒张而降低肺小血管阻力，减轻血管收缩程度(Weigert,1996)。本研究中，高原鼠兔在低氧处理后肺组织Cx40 蛋白水平显著下降，提示高原鼠兔通过降低NO 含量，降低Cx40 蛋白表达水平，减弱低氧性肺血管收缩，以适应高海拔低氧环境。但关于高原鼠兔NO 含量与低氧性肺血管收缩反应调控的关系一直存在争议，NO作用于HPV的靶位点也还待进一步证实。而Cx40基因mRNA 表达量升高表明高原鼠兔Cx40 在转录翻译过程可能受不同通路调控，通过磷酸化、甲基化等翻译后修饰调节间隙连接细胞间通讯(Totlandet al.,2020)，暗示高原鼠兔低氧调控通路的复杂性。

综上所述，高原鼠兔在受到低氧胁迫后，通过降低Cx40 蛋白的表达，抑制血管收缩信号的转导，维持肺动脉压和右心指数的相对稳定，介导其低氧性肺血管收缩反应钝化。本研究定位了Cx40 在高原鼠兔肺组织中表达位点，初步验证了低氧处理后Cx40 mRNA 和蛋白表达趋势，为深入研究Cx40 在高原土著动物低氧适应中的功能提供一定的理论线索。高原鼠兔世代生活在低氧环境中，其bHPV 的遗传分子机制还需进一步基因功能验证。后期我们将基于高原鼠兔肺微血管内皮细胞，采用shRNA 验证Cx40 在高原鼠兔低氧适应过程中的功能。

致谢：感谢湖南农业大学郭松长教授对文章的指导和建议，感谢青海民族大学马晓东博士协助修改论文，感谢青海海北高寒草地生态系统国家野外科学观测研究站提供采样地。