Tnfrsf11aCre介导黄色荧光素蛋白有效标记脑小胶质细胞

杨凤娇，黄紫薇，赵殿元，徐 龙，唐 丽

巨噬细胞是一种广泛分布于全身组织的免疫细胞，在机体的免疫防御、免疫自稳和免疫监视中发挥重要作用[1]。研究[2]表明，脑小胶质细胞来源于卵黄囊巨噬细胞，其他大部分组织定居巨噬细胞主要来源于卵黄囊巨噬细胞和胎肝单核细胞。这些前体细胞进入组织器官后，逐渐分化为成熟的组织定居巨噬细胞。生理状态下，大部分的组织定居巨噬细胞可以通过自我更新维持其稳态[3]。脑小胶质细胞是一种存在于脑与脊髓中的巨噬细胞，约占脑细胞数量的10%～15%，对维持中枢神经系统的正常功能起重要作用，它们能清除中枢神经系统中的神经炎性斑、病原体以及损伤后无功能的神经元与轴突。为了对脑小胶质细胞的发育、稳态维持及功能进行进一步探索，该研究致力于构建有效的脑小胶质细胞条件性敲除小鼠模型。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1实验动物Tnfrsf11aCre小鼠购自北京百奥赛图基因生物技术有限公司，Rosa26yfp小鼠购自美国Jackson实验室。小鼠均饲养于军事医学研究院生命组学研究所SPF级动物房。

1.1.2主要仪器 LSRFortessa SORP 流式细胞分析仪(美国BD公司)，2720 Thermal Cycler PCR仪、PowerPacTM HC凝胶电泳仪、凝胶成像仪(美国Bio-Rad公司)，留置针 (美国BD公司)。

1.1.3主要试剂 0.05 mol EGTA 贮存液(美国Amerso公司)、0.5 mol CaCl2贮存液(北京索莱宝科技有限公司)、肝素钠 (广州赛博生物科技公司)、 RPMI-1640 培养基(美国Hyclone公司)、Collagenase IV (德国Sigma公司)、脱氧核糖核酸酶 I (德国Sigma公司)、OptiprepTM(德国Serumwerk Bernburg AG公司)、Percoll (美国GE Healthcare公司)、红细胞裂解液 (美国BD公司)、基因组提取试剂(成都福际生物技术有限公司)；PCR 引物(北京六合华大基因科技有限公司)，序列见表1。CD45 (30-F11,美国Tonbo公司)、 Ly6C (HK1.4，美国Thermo Fisher Scientific公司)、F4/80 (BM8，美国Thermo Fisher Scientific公司 )、CD64 (x54-5/7.1，美国Biolegend 公司)、CD11b (M1/70，美国Tonbo公司)、CD11c (N418，美国Thermo Fisher Scientific公司)、SiglecF (E50-2440，美国BD公司)、DAPI (美国Tonbo公司)。

表1 Tnfrsf11aCre基因和Rosa26yfp基因PCR序列

1.2 方法

1.2.1Tnfrsf11aCreRosa26yfp小鼠的繁殖分笼与鉴定Tnfrsf11aCre小鼠与Rosa26yfp小鼠交配，得到的子代在2周龄时剪脚趾编号，加入50 μl 基因组提取试剂，混匀，55 ℃烘箱过夜，提取基因组。PCR鉴定小鼠基因型，反应体系：2 μl引物、2 μl蒸馏水、2 μl鼠尾DNA模板、6 μl Mix； 反应条件：Tnfrsf11aCre反应条件为94 ℃、2 min；94 ℃、20 s，65 ℃ (每循环数降0.5 ℃)、15 s，68 ℃、20 s，11个循环数；94 ℃、15 s，60 ℃、15 s，72 ℃、30 s，28个循环数；72 ℃、2 min。Rosa26yfp反应条件为94 ℃、2 min；94 ℃、20 s，65 ℃、80 s，72 ℃、1 min；94 ℃、30 s，60 ℃、30 s，72 ℃、1 min，35个循环数；72 ℃，2 min。配制2.5%的琼脂糖凝胶，待PCR反应结束后，将得到的PCR产物点样置于2.5%琼脂糖凝胶进行电泳，并用凝胶成像仪进行拍照记录。将PCR鉴定得到的Tnfrsf11aCreRosa26yfp小鼠及其同窝对照Tnfrsf11aCre小鼠与Rosa26yfp小鼠留下，3周龄时分笼处理，8周龄时即可用作实验。

1.2.2肝脏、脑、脾脏、肺泡、肾脏巨噬细胞的分离 500 μl/只1.2% 三溴乙醇(德国Sigma)，腹腔注射麻醉小鼠。小鼠麻醉后，乙醇消毒，并将小鼠固定于解剖台，打开腹腔，轻轻拨动内脏，使小鼠肝门静脉暴露，留置针穿刺肝门静脉，从肝门静脉依次灌注含有 0.25 mmol EDTA、5 mmol D-glucose、0.665 mmol肝素钠的I 灌液 (NaCl 0.137 μmol、 NaH2PO4·2H2O 438.226 μmol、Na2HPO4.7H2O 753.733 μmol、KCl 5.298 mmol、Hepes 9.059 mmol、NaHCO34.199 mmol，pH 7.3)；含有20 U Collagenase IV、0.4 U 脱氧核糖核酸酶的Ⅱ灌液灌注结束后，用眼科镊取下消化后的肝脏，放入含有 RPMI-1640培养基的100 mm皿中，70 μm 细胞筛网过滤，制成单细胞悬液。4 ℃，53 r/min 离心去除沉淀细胞，4 ℃，530 r/min 离心取沉淀细胞，加入 2 ml OPtiPrepTM， RPMI-1640培养基定量至5 ml，与细胞沉淀混匀后，在上层加入3 ml RPMI-1640培养基；4 ℃，1 166 r/min 离心25 min(升降速 0)，吸出中间层细胞， 4 ℃，530 r/min 离心取沉淀细胞，加入红细胞裂解液，1 min 后加入 PBE 终止红裂，4 ℃，530 r/min 离心取沉淀细胞，加入流式Stain Buffer 将沉淀细胞冲悬为单细胞悬液。取脑、肾脏、肺脏，用手术剪碎，加入Ⅱ灌注液，37 ℃体外消化45 min后，70 μm 细胞筛网过滤，制成单细胞悬液；取脾脏用眼科镊轻轻撕扯，70 μm 细胞筛网过滤；将获得的脾脏、肾脏、肺脏单细胞悬液4 ℃、530 r/min离心5 min取沉淀细胞，红裂 3 min 后加入 PBE 终止红裂，4 ℃，530 r/min 离心取沉淀细胞，加入适量流式Stain Buffer 将沉淀细胞冲悬为单细胞悬液。过滤后的脑组织单细胞悬液4 ℃、636 r/min离心5 min取沉淀细胞，加入37% Percoll定量细胞沉淀至5 ml并混匀，在混匀的细胞沉淀下方加入5 ml 70% Percoll，室温，636 r/min 离心25 min(升降速 0)，吸出中间透明细胞层，4 ℃，636 r/min 离心取沉淀细胞，加入红细胞裂解液，1 min 后加入 PBE 终止红裂，4 ℃，636 r/min 离心取沉淀细胞，加入适量流式Stain Buffer 将沉淀细胞冲悬为单细胞悬液。

1.2.3标记流式抗体并进行流式细胞分析仪检测 取所获得各组织单细胞悬液各100 μl，并加入 1 μl Fc Black封闭5 min。不同组织巨噬细胞标记流式抗体： 肝脏巨噬细胞和肾脏巨噬细胞CD45 AF700、 Ly6C Pecy7、F4/80 PE、CD64 Bv421；脑小胶质细胞和脾脏巨噬细胞CD45 AF700、 Ly6C Bv421、F4/80 PE、CD11b-Pecy7；肺泡巨噬细胞CD45 AF700、 CD11c Pecy7、SiglecF Bv421。冰上避光标记30 min后，Stain Buffer洗涤2次；向洗涤后的细胞悬液中加入DAPI染料，冰上避光标记45 min后， Stain Buffer洗涤后冲悬细胞沉淀。流式检测YFP标记组织巨噬细胞效率。

2 结果

2.1 实验组与对照组小鼠的基因型鉴定结果Tnfrsf11aCre小鼠与Rosa26yfp小鼠交配获得的子代小鼠共20只，在子代小鼠2周龄时剪下鼠尾，提取基因组DNA，经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳后，鉴定出Tnfrsf11aCreRosa26yfp小鼠9只(2、3、4、5、7、11、12、16、18)，同窝对照小鼠Tnfrsf11aCre小鼠4只(8、9、17、20)，Rosa26yfp小鼠7只(1、6、10、13、14、15、19)。Tnfrsf11aCre琼脂糖凝胶电泳结果见图1，已知Tnfrsf11aCrePCR扩增条带分子量为285 bp；Rosa26yfp琼脂糖凝胶电泳结果见图2，已知Rosa26yfpPCR扩增Cre介导的重组片段分子量为327 bp。

图1 Tnfrsf11aCre小鼠与Rosa26yfp小鼠交配的子代小鼠Tnfrsf11aCre基因PCR琼脂糖凝胶结果

图2 Tnfrsf11aCre小鼠与Rosa26yfp小鼠交配的子代小鼠Rosa26yfp基因PCR琼脂糖凝胶结果

2.2 肝脏、脑、肾脏、脾脏、肺泡巨噬细胞流式分析圈门策略流式细胞分析仪检测在肝脏、脑、肾脏、脾脏、肺泡巨噬细胞中表达YFP的情况。首先根据FSC-A和SSC-A圈出细胞群，第2步根据FSC-H和FSC-A去除细胞粘连体，第3步根据DAPI标记，去除死细胞，由于巨噬细胞是免疫细胞，均表达CD45，第4步圈出CD45阳性细胞群，接着根据不同组织巨噬细胞特异性表达蛋白，圈出目的细胞群；肝脏巨噬细胞、脑小胶质细胞、肾脏巨噬细胞、脾脏巨噬细胞在CD45阳性细胞群的基础上，圈出Ly6C阴性细胞群，去除单核细胞干扰，再分别圈出F4/80+CD64+的肝脏巨噬细胞(图3A)、F4/80intCD11b+的脑小胶质细胞(图3B)、F4/80+CD64+的肾脏巨噬细胞(图3C)、F4/80+CD11blow的脾脏巨噬细胞(图3D)；肺泡巨噬细胞在第4步的基础上，根据其特异性高表达SiglecF和CD11c，圈出SiglecF+CD11c+的肺泡巨噬细胞(见图3E)。圈出组织巨噬后，检测YFP表达情况。

图3 肝脏、脑、肾脏、脾脏、肺泡巨噬细胞流式分析圈门策略

2.3Tnfrsf11aCre介导荧光素蛋白YFP标记组织巨噬细胞效率对分离的组织单细胞悬液进行流式分析后，计算Tnfrsf11aCreRosa26yfp小鼠及其对照Tnfrsf11aCre和Rosa26yfp小鼠肝脏、脑、肾脏、脾脏、肺泡巨噬细胞中表达YFP的比例，发现对照组Tnfrsf11aCre小鼠和Rosa26yfp小鼠的脑小胶质细胞、肾脏、肝脏、脾脏、肺泡巨噬细胞均不表达YFP，但在实验组Tnfrsf11aCreRosa26yfp小鼠中，脑小胶质细胞表达YFP为(91.27±3.70)%(图4A)；肾脏巨噬细胞表达YFP为(86.00±7.02)%(图4B)；肝脏巨噬细胞表达YFP为(63.60±10.35)%(图4C)；脾脏巨噬细胞表达YFP为(69.66±10.22)%(图4D)；肺泡巨噬细胞表达YFP为(32.76±13.35)%(图4E)。这说明Tnfrsf11aCre介导YFP对脑小胶质细胞具有较高的标记效率，而对肝脏、肾脏、脾脏、肺泡巨噬细胞的标记效率低。

图4 Tnfrsf11aCre介导荧光素蛋白YFP标记组织巨噬细胞效率

3 讨论

Cre/Loxp系统生成的小鼠可提供组织或器官中细胞的信息，是了解组织发育、探索调节细胞命运的机制和疾病发生发展的强有力工具[4]。巨噬细胞是机体免疫系统的重要组成部分，不同组织巨噬细胞对于维持机体稳态发挥着不同的作用。例如，肝脏巨噬细胞通过清除病原体，维持机体免疫细胞稳态[5]；肺泡巨噬细胞通过清除肺泡表面活性物质，维持肺脏的功能稳态[6]；脾脏红髓巨噬细胞通过吞噬清除衰老的红细胞，维持脾脏功能稳态[7]；小胶质细胞清除凋亡神经元、介导中枢神经系统损伤和疾病的内源性免疫反应，从而调节神经元数量、发挥神经保护或神经毒作用[8]。因此，探究组织巨噬细胞的发育、稳态维持具有重要的意义。

已有用于研究巨噬细胞的Cre/Loxp工具鼠大都存在一定的缺陷。例如Vav1Cre小鼠存在敲除范围过于广泛的问题，不仅能够敲除巨噬细胞、粒细胞、单核细胞等免疫细胞，还可以敲除部分内皮细胞[9]；Lyz2Cre小鼠不仅可以实现肺泡巨噬细胞等组织巨噬细胞的敲除[10]，还可以敲除粒细胞、单核细胞及部分树突状细胞，并且其重组效率不稳定，对脑小胶质细胞的敲除效率很低[11-12]。本研究中，发现Tnfrsf11aCre介导YFP可以有效标记脑小胶质细胞，在不同组织巨噬细胞中，Tnfrsf11aCre介导YFP标记的效率不同可能是因为在不同组织巨噬细胞中Tnfrsf11a的表达丰度不同导致的。

Tnfrsf11a基因编码的蛋白是TNF受体超家族成员11a，胚胎10.25 d时即在小鼠巨噬细胞前体细胞中表达。鉴于Rosa26基因表达的普遍性，本研究构建了Rosa26靶向载体，插入Loxp-Stop-Loxp-YFP序列。将Tnfrsf11aCre小鼠与Rosa26yfp小鼠交配，获得的Tnfrsf11aCreRosa26yfp小鼠表达Tnfrsf11a的细胞即表达Cre酶，Cre酶可以识别Stop位点两端的Loxp位点，并进行切割，切割后表达的Rosa26基因的细胞同时表达YFP蛋白，发出黄色荧光。研究证明Tnfrsf11aCre介导YFP对于脑小胶质细胞具有90%以上的标记效率，而对肝脏、脾脏、肺泡巨噬细胞的标记效率分别只有63.60%、69.66%、32.76%，用来做这些巨噬细胞的报告基因小鼠是远远不够的。因此，Tnfrsf11aCre小鼠可以用做研究脑小胶质细胞发育分化、稳态维持及功能的工具鼠。