金丝桃素对小鼠生长性能、脏器指数及盲肠微生物多样性的影响

2022-09-20宋雨桐张子豪吕海璇赵昱阳高一帆徐思齐何玉华邓佳玫

畜牧与饲料科学 2022年5期

宋雨桐，张子豪，吕海璇，赵昱阳，高一帆，徐思齐，何玉华，邓佳玫

（吉林农业科技学院动物科技学院，吉林左家 132109）

金丝桃属植物的分布范围很广，在我国西南地区种类和数量比较丰富，在东北地区较少，目前仅见3 种，即长柱金丝桃、短柱金丝桃和乌腺金丝桃。金丝桃属植物中的金丝桃素、类黄酮、蒽酮、蒽醌类、酰基氯葡糖醇等活性物质对机体具有保健功能［1］。研究表明，金丝桃素具有抗病毒功能，如抗艾滋病病毒、禽流感病毒、口蹄疫病毒等［2］；并且具有抗多种肿瘤的功能，包括一些危害严重的神经瘤等；还具有抗抑郁、消炎等功效［3］。金丝桃素适用于畜禽多种病毒性疾病和缓发的细菌性疾病及混合感染引起的体质下降、营养不良等情况，具有预防疾病、改善代谢和维持肠道健康状态、促进动物生长等作用，因此，金丝桃素成为饲料添加剂领域研究的热点之一。该研究通过在小鼠饮水中添加金丝桃素，评价其对小鼠生长性能、脏器指数及盲肠微生物多样性的影响，以期为金丝桃素作为饲料添加剂的开发和应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验药品

金丝桃素（0.3%），购自陕西恒德堂原料提取厂。

1.2 实验动物及饲养管理

选择100 只生长发育良好、4 周龄雌性昆明小鼠，由吉林省农安县开安镇聚欣实验动物经销处提供，单笼饲养，鼠笼内垫有1.5～2.0 cm 厚的木屑垫料，每个鼠笼单独配1 个水瓶（250 mL），整个试验期间小鼠自由采食、自由饮水。

1.3 仪器及器械

电子秤（型号：YP10002），购自上海衡际科学仪器有限公司；小鼠饲养笼、繁殖笼、垫料、小鼠笼架、耳号、耳号钳、冻存管、注射器、剪刀、毛细管、镊子、烧杯等实验室常用器械。

1.4 试验设计

将100 只小鼠随机分为5 个处理组中，分别为0 g/L 组、1 g/L 组、2 g/L 组、4 g/L 组、8 g/L 组，每组20 只。将金丝桃素溶于水，供小鼠饮用，各组金丝桃素在饮水中的添加量分别为0、1、2、4、8 g/L。试验周期为33 d，预饲期5 d，正饲期28 d。小鼠日粮组成及营养水平见表1。

表1 小鼠日粮组成及营养水平

1.5 测定指标及方法

1.5.1 生长性能

在正式试验的第1 天早上，用电子秤对小鼠进行空腹称重，作为试验初始体重［4］；于试验最后1 天早上，对小鼠进行最后1 次空腹称重，作为试验末体重；计算平均日增重，平均日增重（ADG）=（试验末体重-试验初始体重）/试验天数［5］。正饲期每天记录给料量和剩料量，统计试验期间总采食量，计算平均日采食量，平均日采食量（ADI）=试验期间总采食量/试验天数［6］。根据平均日采食量和平均日增重计算料重比［7］，料重比（F/G）=平均日采食量/平均日增重［8］。另外，观察各组小鼠试验期间健康状况，记录死亡小鼠数量，计算死亡率。

1.5.2 脏器指数

采用颈椎脱臼法处死小鼠［9］，采集心脏、肝脏、肾脏和脾脏，去除周围脂肪及多余组织后称重，计算脏器指数［10］，脏器指数=内脏器官重/体重。

1.5.3 盲肠微生物多样性

在0 g/L 组、1 g/L 组、2 g/L 组、4 g/L 组小鼠中每组随机选择5 只小鼠，在冰上用无菌棉签采集盲肠内容物置于1.5 mL 离心管中，共采集20个样本，于-80 ℃冰箱暂时保存，用于菌群高通量测序。

高通量测序由杭州谷禾信息技术有限公司完成。样本接收后提取总DNA，对样本进行质检，质检合格后进行PCR 扩增。对细菌16S rDNA V4 区域进行PCR 扩增，引物为515F （5′- GTGCCAGCMGCCGCGGTAA -3′ ）和 806R （5′ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。扩增完成后进行琼脂糖凝胶电泳检测，确认PCR 产物合格且同批次阳性对照和阴性对照正常，然后进行混样及文库质控。用Illumina HiSeq 平台对检测合格的文库进行高通量测序［11］，得到的测序数据用于物种鉴定分析。

1.6 数据分析

试验数据以“平均值±标准差”的形式表示。数据用Excel 初步整理，用SPSS 19.0 统计学软件进行单因素方差分析，用Duncan′s 法进行多重比较，P<0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 金丝桃素对小鼠生长性能的影响

由表2 可知，饮水中添加1、2、4 g/L 的金丝桃素可提高平均日增重（P>0.05），并且随着饮水中金丝桃素添加量的增加，小鼠的平均日增重呈先升高后降低趋势，4 g/L 组平均日增重最高，比0 g/L组增加21.21%；平均日采食量总体呈现先升高后降低趋势（P>0.05），2 g/L 组平均日采食量最高，比0 g/L 组增加18.30%；料重比呈现波动变化（P>0.05），4 g/L 组最低，比0 g/L 组降低9.24%；0 g/L组有1 只小鼠死亡，死亡率为5.00%，其他4 组无小鼠死亡，死亡率均为0。

表2 不同浓度金丝桃素对小鼠生长性能指标的影响

2.2 金丝桃素对小鼠脏器指数的影响

由表3 可知，1 g/L 组、2 g/L 组、4 g/L 组、8 g/L 组的心脏指数显著（P<0.05）高于0 g/L 组；各组肝脏指数和脾脏指数无显著（P>0.05）差异；肾脏指数呈现波动变化，4 g/L 组显著（P<0.05）低于1 g/L组。

表3 不同浓度金丝桃素对小鼠脏器指数的影响单位：mg/g

2.3 金丝桃素对小鼠盲肠微生物多样性的影响

如图1 所示，4 组样品的菌群组成在门水平上，以厚壁菌门（Firmicutes）相对丰度最高，其次为拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria），3 个菌门占细菌总数的97.58%。其次为梭杆菌门（Fusobacteria）、脱铁杆菌门（Deferribacteres）、柔壁菌门（Tenericutes）、放线菌门（Actinobacteria）、糖化菌门（TM7）、蓝细菌门（Cyanobacteria）、螺旋体门（Spirochaetes）。

图1 不同浓度金丝桃素对小鼠盲肠内容物门水平菌群结构的影响

由表4 可知，4 组样品的菌群组成在属水平上，相对丰度排在前10 位的菌属依次为普雷沃菌属（Prevotella）、拟杆菌属（Bacteroides）、考拉杆菌属（Phascolarctobacterium）、CF231、颤螺菌属（Oscillospira）、萨特菌属（Sutterella）、副瘤胃球菌属（［Ruminococcus］）、巨单胞菌属（Megamonas）、副拟杆菌属（Parabacteroides）、螺杆菌属（Helicobacter）。饮水中添加1、2、4 g/L 的金丝桃素使小鼠盲肠内容物中的普雷沃菌属（Prevotella）和巨单胞菌属（Megamonas）的相对丰度显著降低（P<0.05）；1 g/L 组、2 g/L 组、4 g/L 组小鼠盲肠内容物中的副瘤胃球菌属（［Ruminococcus］）相对丰度显著（P<0.05）高于0 g/L 组；4 g/L 组小鼠盲肠内容物中的副拟杆菌属（Parabacteroides）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）相对丰度显著（P<0.05）高于0 g/L 组。

表4 不同浓度金丝桃素对小鼠盲肠内容物属水平菌群相对丰度的影响单位：%

3 讨论

目前，关于金丝桃素对动物生长性能的影响研究相对较少。金丝桃素（6～12 mg/只）使感染球虫雏鸡的日增重由4.27 g 增加到6.70 g，相对增重率由44.0%提高到69.0%［12］。该试验中金丝桃素增加了小鼠采食量，平均日增重也有所提高，4 g/L组料重比最低，与何绍港等［13］报道的乌腺金丝桃提取液能够降低料重比的结论一致，可见适宜水平的金丝桃素能够使小鼠提高饲料转化率。

金丝桃素对心悸、胸闷、胸痛等症状具有缓解作用［14-15］。相关研究表明，金丝桃素能改善心律失常、心肌缺血以及由于缺血导致的心肌损伤和生理功能下降，还能降低脂质过氧化水平，对心肌缺血再灌注损伤起到保护作用［16-17］，该试验在小鼠的饮水中添加金丝桃素后，心脏指数有所升高，1 g/L 组、2 g/L 组、4 g/L 组、8 g/L 组与0 g/L 组相比差异显著（P<0.05），可能是由于金丝桃素保证了心脏的血流通畅，促进了心脏的发育，增强了心脏的功能。研究表明，金丝桃素能通过减少肝细胞凋亡来提高细胞活力，通过减轻氧化应激、抑制脂肪生成，从而减少肝细胞中脂质的聚积［18］。该试验中2 g/L 组、4 g/L 组、8 g/L 组的肝脏指数降低，可能与金丝桃素促进肝脏脂肪的分解代谢有关。该试验中金丝桃素对小鼠脾脏和肾脏指数无显著影响，并且在一定程度上促进生长、提高饲料转化率。

动物的肠道存在多种微生物，主要包括厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、放线菌门、梭杆菌门和疣微菌门等，该试验中4 组样品的菌群组成在门水平上，以厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门为主。金丝桃提取物可以通过改变厚壁菌、拟杆菌和变形菌的相对丰度调节小肠和结肠中微生物菌群的组成。该试验中金丝桃素使小鼠盲肠内容物中普雷沃菌属、巨单胞菌属水平降低，且差异显著（P<0.05)。普雷沃菌属主要聚集于正常人体的口腔、女性生殖道等部位，是临床上较常见的一种条件致病菌，可引起这些部位的内源性感染；巨单胞菌属是亚洲人肠道的重要菌属，在强直性脊柱炎、自闭症谱系障碍、多动障碍、急性脑卒中、抑郁症状、癌症早期患者肠道中的相对丰度会有所升高［19］。该试验中金丝桃素使小鼠盲肠内容物中瘤胃球菌属、副拟杆菌属、乳杆菌属水平升高，并且差异显著（P<0.05)，这3 种益生菌能够保持肠道菌群平衡，促进肠道健康。瘤胃球菌是降解抗性淀粉的关键菌，并且能有效分解坚硬的植物细胞壁，除此之外在稳定肠道屏障、逆转腹泻、降低结直肠癌风险、减少肾结石等方面具有一定的作用。研究表明，肠道中副拟杆菌属的相对丰度与体重指数（BMI）呈负相关，副拟杆菌具有抗炎特性、还能够调节宿主代谢［20］，另外，副拟杆菌和艾克曼菌互相促进生长介导了生酮饮食（KD）的抗癫痫作用［21］。乳酸杆菌广泛分布于自然界，寄生于肠道的乳酸杆菌对机体具有保护作用。金丝桃提取物能够通过调控2 型糖尿病（T2DM）小鼠的肠道菌群发挥降糖功效［22］，可能是由于提高了小鼠肠道中乳酸杆菌、双歧杆菌的相对丰度，对其改善小鼠T2DM起到了一定作用。研究表明，金丝桃素还能够通过调节肠道微生物群改善溃疡性结肠炎［23］。金丝桃苷能有效调控非酒精性脂肪肝小鼠的肠道菌群结构，提高有益菌的菌群相对丰度，减轻肠道炎症，保护肠黏膜屏障。金丝桃素和金丝桃苷具有抗真菌作用。金丝桃素能够通过不同于光氧化的机制来抑制某些细菌的生长，64 mg/mL 浓度的金丝桃素在没有光照的情况下抑制金黄色葡萄球菌ATCC 29213 和表皮葡萄球菌ATCC 12228 的生长［24］。一定剂量金丝桃素、金丝桃苷在体外对于病原真菌和腐败酵母具有不同的抑制作用［25］。金丝桃素与大肠杆菌细胞结合的能力很强，通过羟脯氨酸的光动力失活作用可以诱导大肠杆菌细胞产生大量的细胞内活性氧（ROS），快速、有效灭活大肠杆菌［26］。综上所述，金丝桃素具有一定的抗炎抗菌以及改善肠道菌群结构的作用。