一株H1N1病毒的分离鉴定

李建华 张智明 何世岷 窦海燕 方 超 刘 旭

（哈药集团生物疫苗有限公司，黑龙江哈尔滨 150069）

1 病毒的培养与纯化

1.1 分离与培养

将处理好的病料溶液过滤后，按0.2 mL/胚的量接种10日龄SPF鸡胚，接种后的鸡胚置于35℃专用恒温孵化箱中(湿度保持为60%～65%)培养，每日检查2次，弃去24 h内死亡的鸡胚，收集24 h后死亡鸡胚的尿囊液。培养72 h结束，取出剩余存活鸡胚，4℃冰箱保存12 h，收取鸡胚液，立即进行红细胞凝集试验。其中，有1份病料在盲传第2代接种时，得到的鸡胚尿囊液可见明显的红细胞凝集，效价为1∶128，对鸡胚进行解剖，胚体出现了水肿和出血点等病理变化，结果见图1、图2。

图1 正常对照鸡胚

图2 接种H1N1病毒的鸡胚

1.2 病毒的克隆与纯化

依据有限稀释的方法对分离株病毒进行纯化，用生理盐水将血凝阳性的尿囊液稀释成10-4、10-5、10-6和10-7等4个梯度，每个梯度分别接种5枚10日龄的鸡胚传代纯化，每次乃对阳性样品中最高稀释度的单胚尿囊液进行收集，用于下一次的传代，连续接种3代后收获存活时间稳定在72 h左右且鸡红细胞凝集价稳定在1∶512的鸡胚。

根据世界卫生组织在1980年通过的流感病毒毒株命名法修正案，将纯化后的病毒，命名为A/swine/SuiHua/6/2015(H1N1)，简称猪流感病毒H1N1亚型SH株。

2 病毒的鉴定

2.1 鸡胚半数感染量 （EID50）的测定

用PBS溶液将病毒液稀释成10-4、10-5、10-6和10-7的浓度，各稀释度分别接种6枚鸡胚，每枚鸡胚0.1 mL，分别收获鸡胚尿囊液，测定其对鸡红细胞凝集价≥1∶16为感染；对鸡红细胞凝集价＜1∶16为未感染，结果显示当稀释度为10-4、10-5时接种鸡胚感染率可达100%，当稀释度为10-6时接种鸡胚感染率为71%，当稀释度为10-7时接种鸡胚感染率为13%。根据表1中的数据，按照Reed-Muench测定其病毒液的病毒含量(EID50)，通过计算得到分离毒株的病毒含量为107.36EID50/0.1 mL。

表1 病毒EID50测定结果

2.2 病毒的血清学鉴定

将纯化得到的病毒株进行血清学鉴定，可知分离株的病毒对猪流感病毒H1亚型特异性抗血清呈现阳性反应；对猪流感病毒的H3、H5以及H9亚型单特异性抗血清检测结果为阴性反应，结果详见表3，表明所得的分离株为H1亚型猪流感病毒。

表2 红细胞凝集抑制试验 （HI）鉴定结果

表3 病毒血凝素热稳定性试验结果

2.3 病毒的电镜鉴定

委托中国农业科学院哈尔滨兽医研究所电镜室对病毒进行电镜鉴定。由图3可知，分离到的病毒株具有典型流感病毒的基本特征：病毒粒子直径在80～120 nm，具有囊膜，同时其表面可见较多放射状的突起，也就是纤突和刺突。与常见的流感病毒的形态大体一致。

图3 电镜观察到的猪流感分离株

2.4 分离病毒的RT-PCR检测

利用设计的扩增引物对所分离出的猪流感毒株进行亚型鉴定。在琼脂糖凝胶电泳的胶图4、图5可见仅H1 U/L和N1 U/L扩增出了与预期扩增片段大小一致的阳性条带，可以确定此分离病毒的HA是H1亚型，NA是N1亚型。

图4 猪流感H1、H3分型鉴定结果

图5 猪流感N1、N2分型鉴定结果

将PCR产物克隆连接到载体上，送上海生物工程有限公司(上海生工)进行测序，对测序结果进行线上BLAST比对。发现该样品HA片段基因与2022年以来，我国多发的H1亚型猪流感病毒分离株的同源性为98%～99%，同时NA的基因片段与我国近年来分离的多株N1亚型猪流感病毒的相同区域的基因同源性在98%～99%之间，表明该样品为H1N1亚型猪流感病毒。

将测序得到的HA基因和NA基因分别用MEGA 6.06软件中的Neighbor-Joining方法构建遗传进化树，进行遗传进化分析[1]。参考序列为从GenBank中选取H1N1亚型猪流感病毒近年来国内外主要流行株的HA、NA基因序列，结果见图6、图7。

图6 H1亚型遗传进化树

图7 N1亚型进化树

2.5 分离病毒的理化特性测定

2.5.1 血凝素热稳定性试验结果

按照热稳定性试验的鉴定方法，将收集的病毒原液置于56℃水浴锅中，分时间梯度对其进行红细胞凝集价的测定，结果见表4。该分离株病毒在56℃处理5 min后其红细胞凝集价均下降2个滴度，符合血凝素热不稳定型的标准，可判定该分离株属于血凝素热不稳定型病毒。

表4 病毒耐热性试验结果

2.5.2 耐热性试验结果

对病毒尿囊液进行56℃处理30 min、65℃处理5 min，或100℃处理1 min，接种鸡胚后测定，无法检测到血凝性[2]，结果见表5。表明该毒株对热敏感。

表5 病毒对乙醚、氯仿和耐酸性试验测定结果 [3-5]

2.5.3 对乙醚敏感的试验结果

将收获的病毒尿囊液用乙醚处理后接种鸡胚后EID50下降2个滴度以上，结果见表5。表明分离株对乙醚敏感。

2.5.4 氯仿敏感试验结果

将病毒尿囊液经氯仿处理后接种鸡胚后EID50下降2个滴度以上，结果见表5。表明分离株对氯仿敏感。

2.5.5 耐酸性试验结果

将病毒尿囊液分别经pH值为3.0和pH值为10.0的条件下，处理后接种到鸡胚，EID50下降2个滴度以上，结果见表5。表明分离株对酸碱敏感。

3 动物回归试验

将满足病毒含量测定要求的分离纯化病毒液用于4周龄健康易感猪进行攻毒试验。综合分析攻毒后感染猪的临床表征、心脏病变和病毒分离结果。结果发现，攻毒组有80%的猪发病，对照组未见猪发病，表明分离株对猪具有较强的致病力，结果见表7、表8和图8、图9。由图8、图9可知，在攻毒猪肺脏的右尖叶、右心叶、左横隔叶、右横隔叶有斑点状或斑块样肉样实变；病理切片表明，攻毒组肺泡壁增厚，肺泡上皮细胞增生，炎症性细胞浸润，部分肺泡腔狭窄或闭塞。

表6 分离株病毒回归猪试验测定结果

表7 分离株病毒回归猪试验各指标测定结果

图8 猪流感病毒攻毒后肺脏病理变化

图9 正常猪肺脏对照组

4 结果与讨论

采集黑龙江绥化地区某猪场发病猪的鼻拭子样本和肺脏组织样本，通过感染鸡胚的方法，成功分离到1株猪流感病毒。并对分离得到的病毒进行了验证和鉴定，通过动物的回归试验发现，分离出的猪流感名都对猪没有致死性，但对猪的致病率可达100%，符合猪流感的一般特性。此外，分离得到的猪流感病毒毒株的全基因组序列、各节段基因的来源及对人有无感染性，还有待于进一步研究。