小麦抗叶锈病新种质的创制与鉴定

赵佳佳，刘鑫，王超，杨武德

（1.山西农业大学 农学院，山西 太谷 030801；2.南京农业大学 作物遗传与种质创新国家重点实验室，江苏 南京 210095）

小麦（Triticum aeistvumL.）是我国的主要粮食作物之一，其产量和品质直接关系到国家的粮食安全。现代育种和农艺技术的进步使得我国小麦产量从2000年的9 990万t增加到2021年的13 695万t[1]。然而，病害是影响谷物产量的重要因素，小麦主要有三大锈病，叶锈病、条锈病和秆锈病[2]，其中，条锈病和秆锈病具有较大的破坏性，而叶锈病较持久、广泛[3]。小麦叶锈病是由叶锈菌引起的真菌性气传病害，主要通过侵染小麦叶片影响光合作用，进而降低籽粒灌浆速率，影响千粒质量和产量[4-6]。在2000—2004年美国因叶锈病导致约3.5亿美元的损失，在我国每年由叶锈病导致粮食减产约300万t[7]。随着抗叶锈病品种的大量利用，近几十年的损伤已经大大减少。但新的病理小种不断出现，全生育期具有强抗性品种较少[8]。因此，寻找新的抗病基因资源、培育持久抗病品种是提高小麦抗病性的基础[9-10]。目前仅有Lr12、Lr13、Lr67、Lr68、Lr75、Lr77、Lr22a、Lr22b、Lr23、Lr34、Lr35、Lr46、Lr48、Lr49和Lr78等 具 有 成 株 期 抗性[11-12]，其中，Lr22a来源于偏凸山羊草（Aegilops tauschii）[13-14]，Lr25和Lr26来源于黑麦[15]，Lr35来源于拟斯卑尔脱山羊草（Triticum speltoides）[16]。随着病原菌与抗病基因的相互选择与进化，一些抗叶锈病基因在育种中被淘汰[17]。目前在我国小麦种植区仅有Lr9、Lr19、Lr38和Lr53等保持较高抗性[18]。此外，由于受自然和人工选择影响，现代育成小麦的遗传多样性降低，基因库狭窄，不利于新的抗病品种培育，寻找和发掘新的抗叶锈病基因备受重视。

小麦近缘物种具有抗白粉病、赤霉病、锈病等多种病害和耐寒、耐盐等耐逆基因，是小麦遗传改良的重要资源。如大赖草不仅具有较强环境适应性，还具有穗大、籽粒大等优良特性[19]；百萨偃麦草含有高分子量麦谷蛋白亚基[20]、光周期[21]等重要基因；冰草具有抗白粉病、叶锈病、条锈病以及多穗、多小花、多分蘖等特性[22]。通过远缘杂交，将野生近缘种中的抗病基因导入到小麦中，是提升小麦抗病性的重要手段[23-25]。目前，基于小麦-近缘植物构建的双二倍体、代换系、易位系以及渗入系等异染色体系，为改良小麦综合农艺性状提供了重要材料。如由小麦-长穗偃麦草创制的含有抗条锈病基因的小偃系列部分双二倍体[26]，含有抗赤霉病基因Fhb7的小麦-偃麦草渗入系[27]，以及小麦-冰草衍生的品系[28]和小麦-中间偃麦草双体异附加系[29]等；其中，小麦-黑麦易位系T1BL·1RS[30]和小麦-簇毛麦易位系T6VS·6AL[31]是利用小麦近缘物种优良基因的成功范例。

黑麦属是小麦野生近缘植物之一，含有丰富的优良基因，如高产、广适和抗白粉病、叶锈病、条锈病等，是改良小麦抗性、提高产量、增强适应性的重要基因资源[23-24]。目前从小麦近缘属植物转入普通小麦中的抗病基因以黑麦最多，如1R、2R、3R、6R染色体上分布的一些抗病基因，特别是小麦-黑麦易位系T1BL·1RS是利用黑麦进行小麦遗传改良最成功的范例[32]，有效地将1RS染色体上携带的Pm8、Lr26、Sr31和Yr9等抗病以及丰产性基因转移到普通小麦中，在国内外受到广泛利用[33]。黑麦作为异交植物，具有较高的遗传多样性，应用潜力较高，但由于杂交结实率低、育种过程繁琐，常规应用于小麦育种较为困难。小黑麦是由小麦和黑麦属杂交得到的一种新物种，结合了小麦和黑麦的优良性状，且与普通小麦更易杂交，为利用黑麦的抗病基因改良小麦搭建起一座“桥梁”。

为寻找新的抗叶锈病资源，并为培育持久抗病品种提供优异的中间型育种材料，本研究前期通过八倍体小黑麦和普通小麦杂交获得异源染色体系H445，对其进行成株期叶锈病抗性鉴定、农艺性状评估以及细胞学鉴定，旨在为这些材料的深入研究和利用提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

选取八倍体小黑麦H800、普通小麦L311、异源染色体系H445和感病对照铭贤169为材料。采用5个高毒性的叶锈菌混合生理小种PHJS、THJS、THSF、FHJS和THRT进行抗病检测，上述材料均由山西农业大学小麦细胞工程与分子育种实验室提供。

1.2 H445抗叶锈病鉴定

将H445、2个亲本和感病对照铭贤169于2020年10月和2021年10月播种于山西农业大学试验田。试验采用随机区组设计，3次重复，每个材料播种4行，行长1.5 m，行距0.3 m，每5行种植1行感病对照铭贤169，并在种植材料两侧垂直播种铭贤169作为诱发行。参照LI等[34]的田间接种法，利用混合生理小种对诱发行进行接种。成株期抗病性鉴定具体操作按照GB/T 19557.2—2004进行，0～2级为抗病，3～4级为感病（表1）。

表1 成株期小麦叶锈病标准Tab.1 Criteria for leaf rust of wheat at adult stage

1.3 细胞学鉴定

根尖取样：将待鉴定的种子置于垫有2层湿润滤纸的玻璃培养皿内，放至24℃恒温培养箱培养至根长为1.5～2.0 cm，将0.1 mmol/L甲基胺草磷溶液（Amiprophos-methyl，APM）倒入培养皿浸没种子，放于24℃恒温箱继续培养2 h后倒掉APM；用清水冲洗种子2～3次后，剪取根尖后放于0.5 mL离心管（盖子上有孔），向管中喷少许水。将离心管置于笑气（一氧化二氮）罐中（0.8～1.2 MPa）处理1.5 h（室温）。取出，加入90%的预冷冰醋酸，于4℃冰箱中固定7～8 min，吸干将根尖转移至含有70%乙醇的离心管中，-20℃冰箱保存备用。

染色体制片：取出根尖置于45%醋酸中解离5 min，切掉根冠，轻轻将根尖分生区组织置于载玻片上，滴适量45%的醋酸溶液，盖上盖玻片，轻敲使细胞分散，用酒精灯外焰烘烤载玻片，待雾气散开后压片；在相差显微镜下观察，将细胞分裂相好的载玻片快速放于-70℃冰箱中保存6 h以上；揭去盖玻片，放于100%无水乙醇中脱水6 h以上，气干备用。

标记探针：本研究所用探针为黑麦基因组探针和寡核苷酸探针。以黑麦基因组为探针，用Fluorescein-12-dUTP通过切口平移法标记DNA，15℃下标记2 h，-20℃避光保存备用。寡核苷酸探针利用探针套ONMP#7：包括TAMRA（红色）修饰 的pAs1-1、pAs1-3、pAs1-4、pAs1-6、AFA-3、AFA-4、pSc119.2-1、Grass-5S-1、Grass-5S-2和FAM（绿 色）修 饰 的（GAA）10、BSCL135-1和BSCL135-2共12个探针，探针序列如表2所示。

表2 ONMP#7探针序列Tab.2 Probes sequence of ONMP#7

原位杂交：参照WU等[35]的方法进行荧光原位杂交。以Fluorescein-12-dUTP标记的黑麦基因组DNA和ONMP#7探针进行原位杂交，在Olympus BX53或Olympus BX60型荧光显微镜下镜检，用SPOT CCD（SPOT Cooled Color Digital Camera）拍摄图像。

1.4 H445农艺性状调查

2020—2021、2021—2022年度，在山西农业大学东阳试验基地种植试验材料。调查H445、H800和L311品种农艺性状，包括株高、分蘖数、穗长、小穗数、千粒质量、粒长、粒宽等，调查10个株系，3次重复。籽粒收获后，并进一步测定蛋白质含量、湿面筋含量、沉降值、形成时间、稳定时间和拉伸面积等品质指标，3次重复。

1.5 数据分析

利用SPSS 20.0软件进行数据统计分析和显著性检验。

2 结果与分析

2.1 小麦-黑麦新种质H445的创制

八倍体小黑麦是普通小麦和黑麦的异源双二倍体，具有抗病虫、耐逆、蛋白质含量高等特点，将人工合成的八倍体小黑麦与普通小麦进行回交，可加强小麦特性，能有效创制新种质。八倍体小黑麦H800植株高156 cm，分蘖力强，具有抗白粉病、条锈病和叶锈病等特性。以八倍体小黑麦H800和普通小麦L311进行杂交，获得一个杂种F1，再与L311回交获得BC1F1植株。BC1F1植株连续自交3代，分别在F4和F5通过形态学和细胞学鉴定分离筛选具有双亲特性、抗叶锈病和综合性状好的植株，在此基础上，经细胞学鉴定，选取花粉母细胞减数分裂中期染色体构型为21个二价体的30个单株；进一步自交，于F7和F8选育性状稳定、抗叶锈病的纯系植株，命名为H445。

2.2 小麦-黑麦新种质H445细胞学鉴定

染色体组成影响植株性状[35]，进一步对2个亲本和H455的染色体组成进行鉴定，八倍体小黑麦的染色体组成为56条，普通小麦L311染色体组成为42条，经细胞学鉴定，H445染色体组成为42条染色体，是小麦-黑麦异源六倍体（图1-a）。以黑麦基因组DNA为探针、中国春基因组DNA作封阻进行原位杂交（GISH），结果显示，12条染色体呈绿色信号，其余30条染色体未有信号（图1-b），表明H445携带12条黑麦染色体和30条小麦染色体，为小麦-黑麦异源部分双二倍体。进一步利用ONMP#7进行FISH鉴定，检测到小麦B基因组的全部14条染色体（1B～7B），A基因组仅含有12条，未检测到染色体6A，而D基因组仅鉴定到2D和6D染色体，其余12条染色体分别为黑麦的1R、3R、4R、5R、6R和7R（图1-c～f）。。

图1 H445的染色体组成Fig.1 Chromosomal composition of H445

2.3 新种质H445的抗病性鉴定

亲本八倍体小黑麦H800对叶锈菌表现为近免疫或高抗，普通小麦L311对混合菌表现为高感。异源染色体系H445植株健壮，有效分蘖较多，结实性良好。经多年田间自然发病和接种鉴定，发现H445的穗、叶均未受到叶锈菌的侵染，表现为免疫；而亲本L311的穗部和叶片均呈现点状斑点，特别是旗叶和穗部斑点较多，感病性最强，植株整体表现出早衰症状（图2）。可见，小麦-黑麦新种质H445在成株期具有较强的叶锈病抗性，推测其抗叶锈病基因可能来自于八倍体小黑麦H800的黑麦染色体。

图2 H445成株期抗病性鉴定Fig.2 Identification of disease resistance of H445 at adult stage

2.4 H445农艺性状分析

对普通小麦-黑麦新种质H445及其亲本H800和L311的农艺性状进行统计分析（表3）发现，不同年份下亲本H800和L311的主要农艺性状表现一致，在株高、分蘖数、小穗数、穗长、粒长、粒宽等性状间存在显著差异，均表现为小黑麦H800显著高于普通小麦L311。异染色体系H445株型较紧凑，植株形态介于双亲之间，与2个亲本比较可知，受八倍体小黑麦H800的影响，H445株高（106.34 cm）较普通小麦L311株高显著增加9.45%。H800的穗长较长，为12.37 cm，具有34.18个小穗数，显著高于普通小麦L311；而H445与L311表现较一致，穗长为7.86～8.99 cm，小穗数为20.21～24.56穗，均表现为显著小于H800。此外，提高穗数是产量提升的决定性因素，经鉴定H445和H800植株的有效分蘖数较多，平均为12.88个，与亲本L311差异显著，显著增加45.20%。表明小麦-黑麦新种质H445具有分蘖多的特点。千粒质量作为构成产量的主要因素之一，2021年2个亲本的千粒质量分别为38.14、43.22 g，而H445的千粒质量为52.32 g，与2个亲本比较，H445在籽粒质量、粒长和粒宽等指标上均有一定程度的提高，其中，千粒质量的提高达到显著水平，较普通小麦L311显著增加24.98%；粒长和粒宽分别为8.12、3.21 mm，与H800差 异 不 显 著，较L311显 著 增 加，2021年 与2022年两年度表现一致（表2）。表明黑麦染色体对小麦的籽粒质量和粒径等性状值具有显著促进作用。

表3 H445的农艺性状比较Tab.3 Comparison of agronomic traits of H445

2.5 H445品质测定

八倍体小黑麦除有较强的抗逆性外，籽粒的蛋白质含量平均为16%，而小麦仅含13%；赖氨酸含量平均为全蛋白质的3%～4%，也高于小麦。为了检测小麦-黑麦新种质H445的品质表现，采用IM9100型近红外谷物分析仪对2个亲本和H445籽粒的蛋白质含量、沉降值、湿面筋含量以及面团形成时间、稳定时间和拉伸面积等6个品质指标进行测定。从表4可以看出，新种质H445的蛋白质含量为14.96%，L311为14.00%，二者差异显著；而沉降值、湿面筋含量以及面团形成时间、稳定时间和拉伸面积与普通小麦L311间差异均不显著。H445与八倍体小黑麦H800相比，品质性状间差异不显著。表明导入到小麦中的黑麦染色体携带有提高蛋白质含量的基因。

表4 H445的品质性状Tab.4 Quality traits of H445

3 结论与讨论

小黑麦是通过远缘杂交技术，将黑麦和普通小麦杂交合成的属间杂种，是一种中间材料，不仅具有黑麦的抗病、耐逆等特征，也具有普通小麦的农艺表型，是改良小麦的重要桥梁。八倍体和六倍体小黑麦在向普通小麦转移黑麦基因过程中，利用最广、发挥作用最大。其中，八倍体小黑麦与普通小麦杂交，后代性状分离小，遗传稳定性好，为选育优良性状的小麦-黑麦品系提供了材料。本研究以八倍体小黑麦和普通小麦杂交创制了小麦-黑麦新种质H445，经鉴定为异源部分双二倍体。异源双二倍体具有小麦野生近缘属抗病、耐逆以及普通小麦优良品质和农艺性状等特点，是进一步向栽培小麦中转移优良外源基因的桥梁，同时也是继续创制异附加系、异代换系、易位系、渗入系的基础材料，在小麦遗传改良中具有重要的利用价值。前人曾利用小麦与长穗偃麦草杂交获得了一批小偃系列部分双二倍体，如小偃693和小偃68[36-37]，小麦-中间偃麦草双二倍体[38-44]，以及烟农15背景下的八倍体小偃麦TE183、TE185和TE347[45-48]已被广泛用于小麦遗传改良。本研究中创制的小麦-黑麦异源六倍体H445含有12条黑麦染色体和30条小麦染色体，可作为后续创制异染色体系和培育优异种质的桥梁材料。

优异种质资源是小麦育种的基础，针对目标性状合理选用种质亲本，可高效培育新种质。作为小麦远缘杂交的产物——小黑麦具有很多优良基因和强的杂种优势，表现出与普通小麦一致的农艺性状。本研究中创制的小麦-黑麦新种质H445对叶锈病表现出较强抗性，维持了叶片的正常光合，保证了籽粒的正常灌浆，与感病小麦L311相比，千粒质量显著增加；此外H445还具有较高的分蘖数。可能是黑麦染色体上携带有优异基因的作用，异源染色体系H445可运用于小麦产量性状的改良中。小麦籽粒蛋白质含量和沉淀值是小麦品质育种的重要目标性状。本研究发现，小麦-黑麦新种质H445的面团品质性状与普通小麦差异不大，但蛋白质含量增加，可能是因为黑麦1RS携带有黑麦碱（Secalin）合成基因，因而使面团的稳定性和延伸性降低，进而影响其烘烤和蒸煮品质，但对蛋白质含量的影响不大。这与DHALIWAL等[49]和BULLICH等[50]利用T1BL·1RS易位染色体对小麦籽粒蛋白质含量影响研究结果相一致。然而也有研究表明，在任何遗传背景下，1BL/1RS易位对SDS沉降值均有不良效应[50]。总之，要阐明具体哪条黑麦染色体携带有控制抗病性、产量表型和品质性状的基因，需进一步利用该材料创制不同类型的易位系、代换系等异染色体系，寻找并挖掘相关性状的基因位点。