养血柔肝丸对多因素诱导的肝纤维化大鼠模型TGFβ1/Smad信号通路的影响

柴 焱， 张 涛， 范引科 ，惠爱武， 赵林涛， 李 芳， 张小丽

1 宝鸡市中医医院 临床药学室， 陕西 宝鸡 721000； 2 清华德人西安幸福制药有限公司，西安 710043； 3 陕西省中医药研究院中药研究所， 西安 710003

肝纤维化是指各种致病物质反复长期刺激肝细胞，致使细胞外基质(extracellular matrix，ECM)沉积于肝细胞的一种慢性损伤反应，是导致肝硬化、肝癌等严重肝脏疾病的重要因素[1]。转化生长因子(transforming growth factor，TGF)β1对肝纤维化形成产生至关重要的影响，被认为是肝星状细胞(HSC)激活过程中极其重要的物质。Smad蛋白是TGF将通路信号传至细胞核内的重要下游信号因子，TGFβ1通过激活下游信号调控因子Smad2和Smad3对其促肝纤维化产生影响。研究[2]表明肝纤维化小鼠正向调控因子Smad2和Smad3表达明显升高。Smad7则作为TGFβ1/Smad信号通路的负向调控因子，主要通过与Smad3竞争，抑制甚至中断TGFβ1信号传递，从而抑制肝纤维化发生和发展，若清除Smad7基因可导致小鼠肝纤维化的发生[3]，由此可见TGFβ1/Smad信号通路的传递调节及相关基因表达在肝纤维化中发挥重要作用。

在中医理论中并无“肝纤维化”这一病名辨证，常将其归于“癥瘕积聚”的辨证范畴。陕西省中医医院成冬生主任医师根据30多年的临床经验，发现慢性病毒性肝炎导致的肝纤维化患者多属于淤血阻络，肝血虚损证型，从养血柔肝、软坚通络的辨证思路出发，研制出了由多味中药组成的方剂——养血柔肝丸。养血柔肝丸在预防肝纤维化发生、抑制肝纤维化进展方面疗效显著，深受患者推崇。本研究重在观察养血柔肝丸对多因素诱导的肝纤维化大鼠TGFβ1/Smad信号通路的调节作用，深入探索养血柔肝丸治疗肝纤维化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF级雄性SD大鼠50只(体质量为180～220 g)，提供单位：斯贝福(北京)生物技术有限公司，生产许可证号：SCXK(京)2019-0010，实验动物使用许可证号：SYXK(陕)2012-006。大鼠标准饲料喂养，饮用水自由，均分笼饲养，每笼5只，光照与黑暗各12 h交替处理，湿度为50%～60%，温度为20～22 ℃，适应性喂养1周。

1.1.2 实验药物和试剂 养血柔肝丸，提供单位：陕西省中医医院制剂中心，批号：20210403。每克药丸相当于生药2.376 g。组方：当归、熟地黄、酸枣仁、五味子、鸡血藤、鸡内金、阿胶、鳖甲等13味药组成。功能主治：养血柔肝，软坚通络。主要用于慢性病毒性肝炎肝纤维化中医辨证属肝血虚损，瘀血阻络证，症见身困乏力，口干不欲饮，头晕目眩，四肢麻木，齿鼻衄血，纳食减少或尚可，二便调，失眠多梦，舌质暗红苔薄白或薄黄或少苔，脉细弦或脉细弦涩。用法用量：口服，1日2次，1次3～5 g。扶正化瘀胶囊(上海黄海制药有限责任公司，批号：z20020073)；四氯化碳(天津市天力化学试剂有限公司，批号:191008);猪血清(河南巨石生物科技有限公司，生产日期：20210725)；食用酒精(红星二锅头56°)(北京红星股份有限公司)。TGFβ1抗体、Smad3抗体、Smad7抗体均由美国Abcam公司提供；总RNA提取试剂盒(CW0580 03877/05421)、逆转录试剂盒(CW2569 01133/50287)、定量PCR试剂盒(CW0957 01170/20210)均由康为世纪生物科技股份有限公司提供；RIPA裂解液(P0013E 111219200624)由碧云天生物技术公司提供。

1.1.3 主要设备与仪器 3-18R高速低温离心机(江苏恒诺仪器制造公司)；LineGene9600定量PCR仪(杭州博日科技有限公司)；Nano Drop2000超微量分光光度计(美国赛默飞公司)；DYCZ-25E型P4垂直电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；5200multi成像仪(上海天能科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 大鼠的分组与给药 雄性大鼠50只随机分成空白对照组(n=6)、多因素模型组(n=9)、养血柔肝丸高剂量组(n=9)、养血柔肝丸中剂量组(n=9)、养血柔肝丸低剂量组(n=9)和扶正化瘀胶囊组(n=8)，共6组。空白对照组给予正常饮水和正常饲料，剩余各组大鼠给予改良高脂低蛋白饲料，并且第1周每日灌胃10%食用酒精，以后每日灌胃5%食用酒精。除空白对照组外，各组大鼠皮下注射含40%四氯化碳的橄榄油溶液，首次注射5 mL/kg，以后3 mL/kg，2次/周，空白对照组给予等体积橄榄油2次/周。除空白对照组外，各组大鼠腹腔注射猪血清0.5 mL/只，2次/周，空白对照组给予等体积生理盐水2次/周，连续12周。从第7周开始，给予养血柔肝丸，分为高剂量组(9.5 g/kg)、中剂量组(4.75 g/kg)、低剂量组(2.38 g/kg)，扶正化瘀胶囊组(0.75 g/kg)，空白对照组、多因素模型组每日灌胃等量蒸馏水，连续灌胃6周，最后一次给药后，禁食时间8 h，但不限制饮水，麻醉处理大鼠。因大鼠自身对四氯化碳不耐受等原因存在死亡情况，12周后每组大鼠各6只。

1.2.2 肝脏病理学 从各组大鼠肝脏中切取部分肝组织，置于含有4%多聚甲醛溶液中固定，固定时间24 h，再经肝组织脱水、石蜡包埋、连续切片(片厚5 μm，每个肝脏组织制作2张切片)后，一组切片用于HE染色，另一组进行Masson染色。最后经中性树胶封片。

1.2.3 定量PCR检测大鼠肝组织细胞中TGFβ1、Smad3、Smad7 mRNA的表达 采用Prime5.0软件设计β-actin、TGFβ1、Smad3、Smad7基因引物序列(表1)，由西安依科生物有限公司合成。提取肝组织中RNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性，将其逆转录为cDNA，按定量PCR试剂盒要求检测TGFβ1、Smad3、Smad7基因的mRNA表达水平。反应参数:95 ℃ 15 s(变性)、60 ℃ 40 s(退火)，循环40次，检测基因的表达量使用2-△△ct法计算。

1.2.4 Western blot检测大鼠肝组织细胞中TGFβ1、Smad3、Smad7蛋白的表达 使用RIPA裂解液进行肝组织蛋白提取，RIPA提前加入蛋白酶抑制剂，冰上匀浆后在4 ℃下12 000 r/min离心10 min，取上清作为蛋白样品。按BCA试剂盒要求测定肝组织中各蛋白浓度，蛋白加热变性后，用垂直电泳仪分离并转膜到PVDF膜上，并使用浓度为5%脱脂牛奶封闭1.5 h，TBST摇洗膜3次，加入提前配置好的第一抗体，在4 ℃环境下孵育过夜，次日，在室温条件下孵育1 h复温，TBST反复洗膜3次，再加入提前配置好的第二抗体，在37 ℃环境下孵育1 h，TBST反复洗膜3次，使用成像仪进行化学发光成像操作，使用图像分析软件image J对曝光结果进行数据处理。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0统计分析软件进行数据处理。计量资料多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Dunnett-t检验法。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色和Masson染色观察大鼠肝组织病理学变化 HE染色和Masson染色显示空白对照组肝组织中未显示任何纤维化组织增生,肝小叶结构完整、清晰可见，肝组织细胞排列整齐，未显示细胞坏死;多因素模型组可见大量脂肪变性，肝小叶结构破坏严重，肝细胞排列错乱，窦周隙清晰可见胶原纤维延伸，汇管区及汇管区周围纤维化明显，有假小叶形成。与多因素模型组相比，扶正化瘀胶囊组和养血柔肝丸各剂量组的纤维组织增生均有不同程度的降低。养血柔肝丸高剂量组和扶正化瘀胶囊组均可见少量脂肪变性，炎细胞浸润局灶性，小叶间有细小纤维束形成，未形成假小叶的结构。养血柔肝丸中剂量组部分可见脂肪变性，炎细胞浸润局灶性，未形成假小叶的结构。养血柔肝丸低剂量组可见脂肪变性，炎细胞浸润局灶性，汇管区普遍的纤维束，已经形成纤维间隔和假小叶的结构(图1、2)。

2.2 各组大鼠肝组织中TGFβ1、Smad3、Smad7 mRNA表达 与空白对照组相比较，多因素模型组大鼠肝组织TGFβ1、Smad3 mRNA的表达明显升高(P值均<0.05)，而Smad7 mRNA的表达显著降低(P<0.05);养血柔肝丸各剂量组和扶正化瘀胶囊组TGFβ1、Smad3 mRNA的表达与多因素模型组相比均有不同程度的降低(P值均<0.05)，表现出的下调作用与剂量呈正相关，以养血柔肝丸高剂量组效果最为明显。养血柔肝丸各剂量组和扶正化瘀胶囊组Smad7 mRNA的表达与多因素模型组相比均有不同程度的升高(P值均<0.05)，表现出的上调作用与剂量呈正相关，以养血柔肝丸高剂量组作用最为显著(图3)。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

注:a，空白对照组;b，扶正化瘀胶囊组;c，多因素模型组;d，养血柔肝丸低剂量组;e，养血柔肝丸中剂量组;f，养血柔肝丸高剂量组；箭头指示病变。图1 各组大鼠肝组织细胞HE染色(×100)Figure 1 HE staining of liver tissues of rats in each group(×100)

注: a，空白对照组;b，扶正化瘀胶囊组;c，多因素模型组;d，养血柔肝丸低剂量组;e，养血柔肝丸中剂量组;f，养血柔肝丸高剂量组；箭头指示病变。

注: a，空白对照组;b，扶正化瘀胶囊组;c，多因素模型组;d，养血柔肝丸低剂量组;e，养血柔肝丸中剂量组;f，养血柔肝丸高剂量组。

2.3 各组大鼠肝组织细胞中TGFβ1、Smad3、Smad7蛋白的表达 与空白对照组相比较，多因素模型组大鼠肝组织中TGFβ1蛋白的表达明显增加(P<0.05)；与多因素模型组比较，养血柔肝丸各剂量组和扶正化瘀胶囊组大鼠肝组织中TGFβ1蛋白的表达量减少(P<0.05)。与空白对照组相比较，多因素模型组大鼠肝组织中Smad3蛋白的表达明显增加而Smad7蛋白的表达明显减少(P值均<0.05);养血柔肝丸高、中剂量组与扶正化瘀胶囊组大鼠肝组织中Smad3蛋白的表达较多因素模型组降低(P值均<0.05)；养血柔肝丸各剂量组与扶正化瘀胶囊组大鼠肝组织中Smad7蛋白的表达较多因素模型组显著升高(P值均<0.05)，以养血柔肝丸高剂量组作用最为明显(图4、5)。

注: a，空白对照组;b，扶正化瘀胶囊组;c，多因素模型组;d，养血柔肝丸低剂量组;e，养血柔肝丸中剂量组;f，养血柔肝丸高剂量组。图4 Western blot检测各组大鼠肝组织TGFβ1、Smad3、Smad7表达结果Figure 4 Expression of TGFβ1，Smad 3 and Smad 7 in liver tissues detected by Western blot

3 讨论

当肝细胞受到药物、酒精、病毒等长期刺激时，肝细胞会发生自我修复反应，进而发生纤维化，肝纤维化是发展为慢性肝病甚至肝硬化的必经阶段，但是在此阶段尚有逆转的可能，若进入肝硬化阶段则难以逆转[4]。肝纤维化的发生是多种细胞因子通过多条信号通路共同作用的复杂病理发展过程，其中HSC的活化被认为是肝纤维化发生的重要一环[5]，肝脏受到损伤或受到炎症细胞因子的作用，诱导产生ECM，最终导致肝纤维化[6]。

HSC从活化、增殖再到转化为成纤维母细胞，期间产生大量ECM，是发生纤维化的核心机制。目前研究[7-8]发现，TGFβ1是导致肝纤维化最为关键的细胞因子之一。TGFβ1通过激活Smad通路参与肝干细胞促进肝纤维化的过程[9]。在肝纤维化TGFβ1/Smad通路相关研究中，研究较清楚明确的有TGFβ1/Smad2、TGFβ1/Smad3、TGFβ1/Smad4、TGFβ1/Smad7。Smad4基因和Smad7基因反向作用调节TGFβ1信号传导，通过与Smad2基因和Smad3基因竞争性的结合TGFβRⅠ，导致TGFβ1信号传导被阻断，抑制肝纤维化的发展。相关研究[10]显示，Smad3基因是导致小鼠肝纤维化的相关因子，若将该基因移除，可使胶原蛋白表达量显著下降，Smad7基因负向调节表达量则呈显著增长。若将Smad7基因移除，大鼠的HSC数目增多，ECM大量蓄积。Smad7蛋白表达量的增加可以抑制HSC增殖及Ⅰ型胶原的产生，抑制肝纤维化的蔓延[11]。本次实验结果显示，养血柔肝丸能显著降低肝纤维化大鼠肝TGFβ1及Smad3基因的表达，上调Smad7基因的表达，证明TGFβ1/Smad信号通路是养血柔肝丸治疗肝纤维化的作用机制之一。

综上所述，养血柔肝丸具有显著的抗肝纤维化疗效，其机制可能是养血柔肝丸抑制TGFβ1、Smad3基因的表达，上调Smad7基因的表达，抑制TGFβ1/Smad信号通路激活，减少HSC的产生。这为治疗肝纤维化提供了实验基础，为临床进一步使用养血柔肝丸改善肝纤维化、保护肝脏功能提供了更多理论依据。

伦理学声明：本研究方案于2020年6月19日经由陕西省中医药研究院伦理委员会审批，批号：(2020)伦审意见第(512)号，符合实验室动物管理与使用准则。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员以及与公开研究成果有关的利益冲突。

注:a，空白对照组;b，扶正化瘀胶囊组;c，多因素模型组;d，养血柔肝丸低剂量组;e，养血柔肝丸中剂量组;f，养血柔肝丸高剂量组。图5 各组大鼠肝组织细胞TGFβ1、Smad3、Smad7蛋白表达水平Figure 5 Expression of TGFβ1，Smad 3 and Smad 7 proteins in liver tissues of the rats in each group

作者贡献声明：柴焱负责数据整理，撰写论文；张涛、范引科、惠爱武、赵林涛、李芳负责实验操作，数据分析，病理分析，并指导修改文章；张小丽负责课题设计，拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。