组蛋白去乙酰化酶1对非酒精性脂肪性肝病细胞模型胰岛素抵抗的影响

朱 恒， 孔维宗， 黄贵群， 白 昱， 王迎春

1 大连大学附属中山医院 消化二科， 辽宁 大连 116001； 2 大连大学 中山临床学院， 辽宁 大连 116001

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)是我国第一大慢性肝病，临床上无特异表现，通常表现为营养过剩和代谢综合征相关症状[1-2]。NAFLD的发病机制目前最经典的假说仍是Day和James[3]提出的“二次打击”学说，其理论核心在于首次打击的胰岛素抵抗(IR)。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDAC)与组蛋白乙酰基转移酶拮抗修饰染色体各区段组蛋白的乙酰化程度，是基因表达调控的主要方法[4-5]。目前已知HDAC1为抗肿瘤治疗提供了靶点[6]，但对NAFLD发病的影响尚不明确。因此，本实验在细胞水平上研究HDAC1在NAFLD病变过程中对IR的影响，明确可能存在的机制。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂 HepG2细胞(大连理工大学细胞库)；油酸(OA)[生工生物工程(上海)股份有限公司]；牛血清白蛋白(BSA-V，不含脂肪酸)、油红O染色试剂盒、ECL超敏发光液(索莱宝)；CCK-8检测试剂盒(DOJINDO)；一步法RT-qPCR试剂盒、全蛋白提取试剂盒、BCA蛋白含量试剂盒(凯基生物)；Pyroxamide、HDAC1一抗、胰岛素受体底物-1(IRS-1)一抗(Abcam)；Prestained Protein Ladder、HRP标记羊抗兔IgG(ThermoFisher)、β-Actin抗体(巴傲得生物)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养 实验将HepG2细胞于含10%胎牛血清(FBS)和1%双抗的DMEM高糖培养基中进行培养，置于37 ℃、5% CO2培养箱中，至细胞融合率达80%～90%时加入0.25%胰蛋白酶消化细胞，按1∶3比例进行传代及后续操作。

1.2.2 HepG2细胞增殖活力评估 采取CCK-8法，将对数生长期的HepG2细胞按梯度为0.1×104、0.2×104、0.5×104、1×104个，100 μL每孔的密度分别接种至96孔培养板上，每组细胞各设4个复孔。依次待24 h、48 h、72 h后，向各孔内加10 μL CCK-8溶液，继续培养2 h后，在酶标仪上以波长450 nm检测各孔光密度(OD)值。以横轴为细胞数目，纵轴为OD值，生成细胞标准生长曲线。

1.2.3 OA和Pyroxamide浓度筛选 采取CCK-8法，将对数生长期的HepG2细胞计数至0.5×104个，按每孔100 μL的密度接种于96孔培养板上，每组细胞各设4个复孔。细胞贴壁后，依次添加浓度梯度为0、0.125 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L、2 mmol/L的OA和浓度梯度为0、5 μmol/L、10 μmol/L、15 μmol/L、20 μmol/L、25 μmol/L的Pyroxamide继续培养24 h，向各孔内加10 μL的CCK-8溶液，继续培养2 h后，在酶标仪上以波长450 nm检测各孔OD值。

1.2.4 细胞分组 将HepG2细胞分为对照组、模型组和抑制剂组，对照组细胞用DMEM高糖培养基进行培养；模型组细胞用含OA(筛选出的最佳浓度)的DMEM培养基诱导24 h；抑制剂组细胞先用含0.25 mmol/L OA的DMEM培养基诱导24 h，再用加入含Pyroxamide(筛选出的最佳浓度)的DMEM培养基作用24 h。

1.2.5 NAFLD模型验证

1.2.5.1 细胞脂肪变程度检测 将处理过的HepG2细胞以3×105/mL的密度接种于6孔板上，PBS缓冲液冲洗2次，加油红O固定液室温固定30 min；水洗2次浸入60%异丙醇5 min；加入油红O染液，37 ℃避光染色40 min；苏木素染色液复染核2 min，加入缓冲液1 min，以蒸馏水覆盖细胞并于显微镜下观测细胞内的脂滴蓄积程度；60%异丙醇溶解15 min后移至96孔板中，在酶标仪上以波长510 nm检测各孔OD值。

1.2.5.2 常规生化指标检测 将处理过的HepG2细胞以3×105/mL的密度接种于6孔板上，提取细胞上清液，全自动生化仪检测细胞内ALT、AST、TG、TC的含量。

1.2.6 RT-qPCR法检测HDAC1、IRS-1 mRNA的表达 采用RT-qPCR法，提取各组HepG2细胞的总RNA，测定RNA纯度，定量分析后逆转录合成cDNA第一链，引物序列见表1，进行PCR。逆转录反应条件为：45 ℃ 15 min，94 ℃ 2 min。PCR反应条件为：94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 kb/min，35个循环，72 ℃ 5 min。以β-Actin为对照，计算各组别的CT值，用2-△△Ct法分析目的基因的相对表达量。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.2.7 Western Blot法检测HDAC1、IRS-1蛋白的表达

利用Western Blot法，取处理后的HepG2细胞，用全蛋白提取试剂盒提取各组细胞的总蛋白；BCA法对蛋白进行定量分析后将蛋白样品加到泳道上，以140 V恒压电泳90 min；电泳结束后，将样品与PVDF膜放入转印槽中，以80 V恒压、冰浴条件下进行电转60～120 min；转膜后，将PVDF膜置于封闭液中室温封闭1 h，洗膜加一抗4 ℃孵育过夜；洗膜加二抗室温摇床孵育1 h；再次洗膜后加入配好的显色液，室温下与PVDF膜避光反应3 min，进行曝光拍照。

2 结果

2.1 HepG2细胞标准生长曲线 HepG2细胞的不同接种浓度和接种时间对实验后续结果的影响不同，通过绘制细胞标准生长曲线可以筛选出实验最佳的细胞接种浓度和时间范围。HepG2细胞标准生长曲线见图1。通过曲线可知，当细胞密度范围在0.2×104～0.5×104/孔时，HepG2细胞在96孔板中培养48 h的曲线斜率最明显，即处于细胞对数生长期，细胞营养充足，活力良好，增殖速度稳定，适宜用于后续实验。

图1 HepG2细胞标准生长曲线

2.2 OA造模条件的确立 检测不同浓度的OA诱导HepG2细胞24 h后的细胞活性，结果显示，OA浓度在0～0.25 mmol/L范围内对细胞活性并无显著影响，与0 mmol/L组相比，差异均无统计学意义(P值均>0.05)。当OA浓度大于0.25 mmol/L时明显抑制了细胞活性，与0 mmol/L组相比，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表2)。

2.3 HDAC1抑制剂Pyroxamide浓度筛选 通过测定不同浓度HDAC1抑制剂Pyroxamide培养HepG2细胞24 h后的细胞增殖活力结果显示，浓度在0～20 μmol/L范围内Pyroxamide对细胞增殖活力没有明显影响，各浓度Pyroxamide组与0 μmol/L组相比，差异均无统计学意义(P值均>0.05)。Pyroxamide浓度达到25 μmol/L时，细胞生长明显受到抑制，与0 μmol/L组相比，差异具有统计学意义(P<0.05)。因此，选择浓度为20 μmol/L的Pyroxamide为最佳给药浓度(表3)。

表2 不同浓度OA对HepG2细胞活性的影响Table 2 Effects of different concentrations of oleic acid on the activity of HepG2 cells

表3 不同浓度Pyroxamide对HepG2细胞增殖活力的影响Table 3 Effects of different concentrations of Pyroxamide on the proliferation activity of HepG2 cells

2.4 NAFLD模型验证

2.4.1 细胞脂肪变程度检测 油红O染色后可见，对照组细胞形态饱满，边界清晰，胞核呈蓝色，胞内鲜见脂滴；模型组细胞边界模糊，胞内沉积有大量橘红色脂滴，并环形围绕于胞核周围；抑制剂组细胞经20 μmol/L的Pyroxamide处理后胞内橘红色脂滴数量明显少于模型组(图2)。模型组细胞OD值较对照组明显升高，而抑制剂组细胞OD值较模型组显著降低(P值均<0.05)(表4)。结果表明，浓度为0.25 mmol/L的OA成功诱导HepG2细胞构建了NAFLD模型，同时浓度为20 μmol/L的Pyroxamide有效缓解了细胞内脂滴蓄积。

对照组

模型组

抑制剂组图2 各组别细胞内脂滴蓄积程度(油红O染色，×40)Figure 2 The accumulation of lipid droplets in cells in each group (Oil red O staining, ×40)

表4 细胞脂肪变程度比较Table 4 Comparison of the degree of cellular steatosis

2.4.2 生化指标检测 收集各组细胞上清液检测发现，各组细胞ALT、AST、TG、TC含量均不相同：模型组相比于对照组ALT、AST、TG、TC含量均升高，而抑制剂组相比于模型组ALT、AST、TG、TC含量均降低，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表5)。

2.5 RT-qPCR法检测HDAC1、IRS-1 mRNA的表达 RT-qPCR法检测3组细胞HDAC1、IRS-1 mRNA表达，结果显示：与对照组相比，模型组HDAC1 mRNA表达量明显升高，IRS-1 mRNA表达量却显著下降(P值均<0.05)；加用Pyroxamide后，与模型组相比，抑制剂组HDAC1 mRNA表达量下降，IRS-1 mRNA表达量升高，差异均有统计学意义(P值均<0.05)(表6)。

表6 各组HDAC1、IRS-1 mRNA表达量比较Table 6 Comparison of HDAC1 and IRS-1 mRNA expression in each group

2.6 Western Blot法检测HDAC1、IRS-1蛋白的表达 Western Blot法检测3组细胞HDAC1、IRS-1蛋白表达，结果显示：与对照组相比，模型组HDAC1蛋白表达量明显升高，IRS-1蛋白表达量显著下降(P值均<0.05)；加用Pyroxamide后，与模型组相比，抑制剂组HDAC1蛋白表达量明显下降，IRS-1蛋白表达量显著升高(P值均<0.05)(表7，图3)。

表7 各组HDAC1、IRS-1蛋白表达量比较Table 7 Comparison of HDAC1 and IRS-1 protein expression in each group

图3 各组别细胞内HDAC1、IRS-1蛋白的表达Figure 3 Expression of HDAC1 and IRS-1 proteins in cells of each group

表5 各组生化指标比较Table 5 Comparison of biochemical indicators in each group

3 讨论

本实验筛选后选用对细胞活性无明显影响的0.25 mmol/L的OA浓度处理HepG2细胞并进行油红O染色，结果显示模型组细胞内沉积大量脂滴，且细胞未发生裂解死亡，说明0.25 mmol/L的OA能够使HepG2细胞发生脂肪变。OA具有直接细胞毒性，可使细胞发生坏死炎症，同时作为游离脂肪酸的一种，OA可透过细胞膜，产生大量的TG，因此常规生化检测ALT、AST、TC、TG含量模型组显著高于对照组，表明经过OA诱导，HepG2细胞的膜通透性增加，肝酶外溢随之增加，与此同时游离脂肪酸摄入增加，细胞内部产生TG、TC的能力也提高，再次证明0.25 mmol/L的OA浓度诱导HepG2细胞成功建立了NAFLD细胞模型。

表观遗传学是在不改变DNA序列的前提下改变基因的表达，并且部分基因改变可以遗传。现有研究证实表观遗传学参与调控IR、脂质代谢、氧化应激和炎症反应等，组蛋白修饰正是其重要的分子调控机制之一。高脂引发的NAFLD与组蛋白修饰密切相关，其中HDAC1是组蛋白去乙酰化调控的重要元件之一[7]。本实验首先检测了对照组和模型组细胞HDAC1 mRNA及蛋白的表达量，与对照组相比，模型组细胞中HDAC1 mRNA和蛋白表达量明显增加，这说明HDAC1在NAFLD细胞模型中表达上调，验证HDAC1的确参与了NAFLD的发生与发展，并且起到了促进作用，这与之前郭云蔚等[8]在一项对高脂饮食小鼠的研究中发现HDAC1参与了脂肪肝的形成的结果不谋而合。但是有关HDAC1调控NAFLD发生的具体机制尚无明确定论，因此，实验进一步探讨HDAC1影响肝脏脂肪变可能存在的分子靶点。

本实验认为，组蛋白修饰调控脂质代谢和糖代谢，当HDAC1过度表达时即会导致肝脏脂肪变和IR，进一步发展为NAFLD[9]。IRS-1是胰岛素受体底物最经典的成员，在胰岛素作用的外周组织中广泛表达，通过控制胰岛素信息的传递，对机体代谢发挥作用[10]。IRS-1表达缺失或磷酸化异常均会阻碍下游胰岛素信号转导，导致IR[11]。所以本实验猜想HDAC1与IRS-1或许在调节IR导致的NAFLD病程中具有某种联系。因此，实验再次检测对照组和模型组细胞IRS-1 mRNA及蛋白的表达量，结果正与HDAC1表达量相反，与对照组相比，模型组细胞中IRS-1 mRNA和蛋白表达量明显降低。这说明在NAFLD发生过程中，HDAC1表达上调，而IRS-1的表达受到了抑制，但是单纯的NAFLD模型并不能解释IRS-1表达被抑制是否受到了HDAC1的调控，因此实验在模型组的基础上，选取选择性HDAC1抑制剂Pyroxamide设置抑制剂组来验证上述假设。

本实验选取HDAC1高选择性抑制剂Pyroxamide作用于已经建立成功的NAFLD模型细胞，经验证浓度为20 μmol/L的Pyroxamide为抑制HDAC1表达且不影响细胞增殖活力的最佳给药浓度。再次检测并比较对照组、模型组和抑制剂组之间HDAC1和IRS-1 mRNA及蛋白表达量，结果恰如假设，各组细胞内HDAC1 mRNA和蛋白表达量比较，模型组高于对照组，抑制剂组低于模型组，各组细胞内IRS-1 mRNA和蛋白表达量比较，模型组低于对照组，抑制剂组高于模型组。该结果很大程度上表明HDAC1调节IR参与NAFLD发生的分子靶点之一在于IRS-1。既往研究[12]表明，HDAC1参与的去乙酰化修饰属于组蛋白修饰的一种重要方式，HDAC1表达增加会导致组蛋白H3第4位、第9位等不同重要区域赖氨酸乙酰化水平降低，使得靶基因与转录因子的结合位点无法识别，降低基因转录。因此，HDAC1可能是通过调控组蛋白赖氨酸乙酰化水平影响了IRS-1与胰岛素信号的结合，降低IRS-1的转录，使其表达减少，但是HDAC1作用的具体组蛋白结合区域还需要进一步实验验证。结合Khan等[13]在T2DM小鼠中发现丁酸钠通过抑制HDAC抑制了IR，改善了肝脏脂肪变和其另一项实验[14]发现丙戊酸也可以通过抑制HDAC抑制IR和脂质沉积的研究结果，本实验认为，HDAC1增加抑制了IRS-1的表达，进而抑制了下游胰岛素信号的传导，导致IR，参与NAFLD的发生与发展；同时，HDAC1选择性抑制剂Pyroxamide抑制HDAC1后恢复了IRS-1的表达，缓解了肝脏脂肪变，或对肝脏起到保护作用。

仅有少量肝病领域研究证实HDAC1参与了NAFLD的发生且机制未明。因此，本研究验证了此观点并且讨论了HDAC1可以通过抑制IRS-1分子表达来抑制葡萄糖的吸收，促进IR，参与了NAFLD的发生发展；同时，HDAC1抑制剂Pyroxamide可以上调IRS-1表达，改善NAFLD，也证实了假设。但是HDAC1调控IRS-1表达的具体组蛋白结合域和抑制IRS-1介导的具体胰岛素信号通路尚待进一步讨论，同时Pyroxamide的抑制作用仅在体外模型中验证，未来仍需继续利用动物模型来研究其对NAFLD的治疗效果。

利益冲突声明：本研究不存在研究者、伦理委员会成员以及与公开研究成果有关的利益冲突。

作者贡献声明：朱恒负责实验操作，结果分析，起草和修改论文；孔维宗、黄贵群负责实验操作，数据分析；白昱负责收集和整理课题资料，分析数据；王迎春负责课题设计，拟定写作思路，指导撰写文章并最后定稿。