甘草酸通过激活核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1通路减轻急性胰腺炎氧化应激

程 波， 李德剑， 张 岩， 陈三洋， 宋耀东， 王巧芳， 刘艳娜， 朱长举

急性胰腺炎(acute pancreatitis， AP)是一种临床常见的腹部急症，由外分泌胰腺消化酶过度激活引起的可逆炎症过程[1]。大多数AP患者经历轻度疾病过程，10%～20%患者病情进展出现更为严重的重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis, SAP)，甚至发生多器官功能衰竭甚至危及生命[2-3]。目前AP尚无特异性治疗方法。

甘草酸(liquiritigenin， Liq)从甘草中提取，是具有多酚结构的黄酮类化合物，具有多种生化和药理特性，包括抗炎、降脂、抗氧化、抗癌等特性[4-5]，其在AP中的作用尚不明确。氧化应激在AP的发生发展中起重要作用， 核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)/血红素加氧酶1(heme oxygenase-1, HO-1)是调节氧化应激的关键通路，我们推测甘草素通过调控Nrf2/HO-1通路发挥抗氧化作用对AP起保护作用。本研究通过两次L-精氨酸腹腔注射建立小鼠AP 模型，检测AP小鼠血清淀粉酶、血清炎症指标肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-1β(IL-1β)及胰腺组织中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)的表达，免疫荧光观察胰腺组织中活性氧(ROS)的表达，Western blot检测胰腺组织中Nrf2、HO-1的表达探讨甘草酸对AP小鼠的影响及作用机制，为AP的治疗提供新途径。

1 材料与方法

1.1实验试剂 L-精氨酸(北京索莱宝公司)，BCA 蛋白浓度测定试剂盒(北京索莱宝公司)，GAPDH抗体(上海碧云天公司)，Nrf2抗体(美国proteintech公司)，HO-1抗体(美国Abcam公司)，血清淀粉酶(上海酶联公司)、TNF-α、IL-6 ELISA 试剂盒购自武汉云克隆公司，MDA、SOD试剂盒购自南京建成生物有限公司。

1.2AP模型诱导及动物分组 24只C57BL/6小鼠(8～10周，20～22 g)购自北京维通利华公司，适应性饲养1周,随机分为4组：对照组(CON组)、甘草酸对照组(Liq组)、AP 组、AP+甘草酸治疗组(AP+Liq组), 每组6只。CON组：注射生理盐水；Liq组：注射甘草酸(30 mg/kg)[6-8]+生理盐水；AP组：生理盐水+L-精氨酸(4 g/kg, 注射2次，间隔1 h)；AP+Liq组：甘草酸(30 mg/kg)于L-精氨酸造模前1 h腹腔注射。末次注射后72 h处死小鼠，收集血清和病理标本。本实验经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准(2019-KY-140)。

1.3胰腺病理学检查 胰腺组织石蜡包埋，切成5 μm厚的切片，HE染色并在显微镜下观察。根据Schmidt评分准则[9]进行评分。

1.4血清学指标测定 根据ELISA说明书检测血清淀粉酶及炎症因子TNF-α、IL-6水平，用胰腺组织提取蛋白检测MDA、SOD含量，450 nm下检测各个指标水平。

1.5免疫荧光检测胰腺组织ROS的生成 新鲜冰冻组织切片，37 ℃烘箱烘烤10～20 min，固定后抗原修复，画圈并用血清封闭，ROS染液孵育并4 ℃过夜(Sigma，1∶500)，荧光二抗孵育，DAPI避光染色10 min，加入自发荧光淬灭剂，封片并在荧光显微镜下观察并拍照。

1.6Western blot 方法测定胰腺组织中Nrf2、HO-1 蛋白的表达 胰腺组织用RIPA裂解提取总蛋白，BCA定量蛋白质浓度。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，封闭1 h后一抗4 ℃过夜， Nrf2(1∶1000)、HO-1(1∶2000)二抗孵育1 h，化学发光显影。

2 结果

2.1甘草酸减轻L-精氨酸诱导的小鼠AP L-精氨酸诱导AP后，AP组小鼠胰腺组织病理损伤较重，胰腺水肿、炎性细胞浸润和细胞坏死程度及组织学评分等较CON组及Liq组明显加重，而甘草酸治疗的AP小鼠胰腺损伤程度及损伤评分明显减轻。见图1。

注： A 为各组小鼠胰腺病理变化(×100)；B 为各组小鼠胰腺组织坏死、炎细胞浸润、水肿及Schmid 胰腺病理评分的定量分析；CON组为对照组，Liq组为甘草酸对照组，AP组为急性胰腺炎组，AP+Liq组为急性胰腺炎+甘草酸治疗组；bP<0.01，cP<0.05

2.2甘草酸减轻血清淀粉酶、炎症因子及胰腺SOD、MDA水平 与CON组比较，诱导AP后小鼠淀粉酶、炎症因子及MDA明显升高(P<0.01)，SOD明显下降(P<0.01)；Liq组淀粉酶、炎症因子及MDA明显降低(P<0.01和P<0.05)，SOD明显升高(P<0.01)。见图2。

注：各组小鼠血清淀粉酶(A)、TNF-α(B)、IL-6(C)水平，胰腺SOD(D)、MDA(E)水平的定量分析；CON组为对照组，Liq组为甘草酸对照组，AP组为急性胰腺炎组，AP+Liq组为急性胰腺炎+甘草酸治疗组；bP<0.01,cP<0.05

2.3甘草酸减轻胰腺组织中ROS生成 CON组与Liq组未见明显的ROS表达，而AP组中的ROS表达明显增加， 而Liq组降低了胰腺组织中的ROS表达。见图3。

注：CON组为对照组，Liq组为甘草酸对照组，AP组为急性胰腺炎组，AP+Liq组为急性胰腺炎+甘草酸治疗组；ROS为活性氧，DAPI为二氨基苯基吲哚

2.4甘草酸促进胰腺组织中Nrf2/HO-1表达 与CON组比较，AP组Nrf2、HO-1表达明显降低(P<0.05和P<0.01)；与AP组比较，AP+Liq组中Nrf2、HO-1表达明显增多(P<0.05)。见图4。

注：A 各组小鼠胰腺组织Nrf2、HO-1蛋白的表达水平；B、C各组小鼠胰腺组织Nrf2、HO-1蛋白的定量分析；CON组为对照组，Liq组为甘草酸对照组，AP组为急性胰腺炎组，AP+Liq组为急性胰腺炎+甘草酸治疗组；Nrf2为核因子E2相关因子2，HO-1为血红素加氧酶1，GAPDH为内参基因；bP<0.01，cP<0.05

3 讨论

甘草素具有强大的抗炎抗氧化特性，然而其对AP的影响尚未明确。本研究发现，甘草酸治疗(30 mg/kg)减轻了小鼠AP时胰腺损伤严重程度，减轻炎症因子产生，并能抑制ROS的产生减轻氧化应激反应，从而减轻AP的严重程度，提示甘草酸是极具潜力的AP治疗药物。

炎症反应在AP的发生发展中起重要作用，促炎细胞因子的水平严重影响到AP局部及全身器官损伤的程度[10]。促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6在AP的发生发展中起着关键作用，严重时可导致全身性炎症反应和多器官功能衰竭[11-12]。血清TNF-α、IL-1β和IL-6的阻断已被证明可以减弱疾病的进程[13-14]。甘草酸是黄酮类化合物，具有强大的抗炎作用。Zhu等[15]的研究表明，甘草酸可减轻高糖诱导的肾小球系膜细胞系膜基质积累，减少肾小球系膜细胞中IL-1β和IL-6的分泌表达来抑制高糖诱导的炎症反应和氧化应激。本研究用L-精氨酸对小鼠进行两次腹腔注射，成功建立了小鼠AP模型，AP组胰腺组织病理损伤明显，组织学评分明显高于CON组，而甘草酸治疗后胰腺组织损伤明显减轻。与胰腺组织损伤一致及先前的研究结果一致，AP组小鼠血清TNF-α、IL-6水平明显升高，而甘草素治疗降低了小鼠血清TNF-α、IL-6水平，减轻了胰腺病理损伤程度，提示甘草酸可以改善小鼠AP，减轻炎症反应。

氧化反应和抗氧化反应之间的平衡对机体正常生理活动至关重要，AP时二者平衡被打破，大量ROS及MDA产生，GSH、HO-1等抗氧化酶表达减少，导致严重的氧化应激反应，对组织和细胞造成不可逆转的损伤[16-17]。减少重要氧化剂ROS的产生，促进抗氧化酶的产生，对AP具有保护作用。甘草酸具有强大的抗氧化作用。Zhang等[18]的研究表明，甘草酸治疗可减轻三氧化二砷导致的肝毒性，减轻肝细胞内氧化应激反应，减少细胞内ROS的生成，抗氧化酶SOD、GSH等水平升高，MDA水平降低。以此为基础，本研究探讨了甘草酸对AP时体内氧化应激的影响，CON组和甘草酸对照组胰腺组织中几乎未检测到ROS，AP组ROS水平明显升高，而甘草酸治疗减轻了胰腺组织AP触发的ROS积累。与此同时，甘草酸治疗减少了AP时MDA的表达，提高了SOD抗氧化酶的表达，从而平衡氧化与抗氧化的关系，减轻AP的严重程度。

Nrf2 是一种重要的氧化还原敏感性转录因子，正常条件下，细胞质keap1作为E3泛素连接酶3(Cull3)的适配器，通过泛素蛋白酶体系统对Nrf2进行泛素化降解。机体氧化应激时，keap1结构中的反应性半胱氨酸残基可以抑制Nrf2的降解，促进其转移到细胞核中与抗氧化反应元件(ARE)结合，促进如醌氧化还原酶1(NQO1)和HO-1等抗氧化酶基因的表达，从而对抗氧化应激[19-20]。以往的研究[21-22]表明，在AP小鼠的胰腺组织中，Nrf2的表达明显降低，并证实了上调Nrf2的表达对AP有保护作用。此外，多个研究表明， 甘草酸激活Nrf2/HO-1信号通路减轻氧化应激反应，从而减轻疾病的发展。Wang等[23]的研究表明，甘草酸及其同分异构体可以依赖/非依赖地激活Nrf2信号通路，诱导UGT1A1、NQO1 及HO-1等抗氧化酶的表达，抑制小鼠巨噬细胞激活引起的炎症反应。Huang等[24]的研究表明，甘草酸可与keap1竞争Nrf2的结合位点，从而促进Nrf2 核易位并导致 Nrf2 下游抗氧化基因的表达增加，减轻了 MCT 诱导的肝脏氧化应激损伤。与此一致，本研究表明，AP组小鼠胰腺组织中Nrf2/HO-1表达明显减少，而甘草酸治疗明显上调了Nrf2/HO-1的表达，减轻了小鼠AP氧化应激损伤。

综上所述，甘草酸可通过调节Nrf2/HO-1通路，降低AP诱导的炎症和ROS的生成， 为AP的治疗提供实验基础和理论依据。然而，本研究也存在一些限制，未探讨不同浓度的甘草酸对氧化应激的影响，未证实甘草酸对AP的直接影响，后续我们将进一步探讨甘草酸抗炎、抗氧化的最佳作用剂量，并用Nrf2抑制剂及基因敲除鼠来进一步探讨甘草酸对Nrf2的直接作用，及其对线粒体结构及功能的影响。