水杨酰芳胺衍生物通过抑制STAT-3对肝癌HepG-2细胞的影响

胡敏华 邾枝花

我国是乙型肝炎病毒感染的高发区，也是肝癌发病的高发区[1-2]。由于肝癌早期无明显临床症状，肝癌患者一旦发现病情发展都处于中晚期，化疗是中晚期肝癌治疗的主要方式，目前应用于治疗肝癌的靶向药主要有索拉非尼（Sorafenib ）、仑伐替尼（Lenvatinib）及纳武单抗（nivolumab），以上靶向药主要的靶点是EGFR、VEGFR、PDGFR-α等。随着时间的推移，目前治疗肝癌的靶向药耐药性也逐渐显现，针对新靶点肝癌治疗药物的研发迫在眉睫。

信号转导及转录激活因子3（STAT-3）可能与肝癌的发生早期阶段有一定关系，同时STAT的过度表达与肝癌的病理分期呈正相关性，阻断STAT-3的磷酸化可发挥抑制肝癌晚期肿瘤细胞的侵袭和转移能力，从而影响肝癌患者的预后及生存期。STAT-3是STAT家族中的重要一员，STAT-3也是与肿瘤的发生和发展关系最密切的转录因子之一[3-4]。肝癌作为致死率较高的癌种，其与STAT-3过度活化之间的相关性也引起了越来越多研究者的关注[5]。笔者前期实验也证实了水杨酰芳胺衍生物N-（3-氯-4-氟苯基）-2-羟基-4-（3-（哌啶-1-基）丙氧基）苯甲酰胺（NPBM）和N-（3-氯-4-氟苯基）-2-羟基-4-（3-吗啉丙氧基）苯甲酰胺（NMBM）对表皮鳞癌A431细胞和肺腺癌A549细胞的增殖具有不同程度的抑制作用，且能通过抑制肿瘤细胞中表皮生长因子受体（EGFR）活性及STAT-3发挥抗肿瘤活性[6]，因此本试验拟研究化合物NPBM和NMBM对肝癌HepG-2细胞中STAT-3的影响，期望合成化合物通过作用于STAT-3发挥抗肝癌的作用，研究出新靶点的抗肝癌靶向制剂。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器 CP225D万分之一电子天平（Sartorious）；ZF-7三用紫外灯（上海嘉鹏科技有限公司）；SCV-4A1垂直流超净台（新加坡艺思高科技有限公司）；Thermo 3111型CO2培养箱（美国Therm-Electron公司）；Eclipse TS100-FDH1型倒置光学显微镜（日本 Nikon公司）Spectramax M2e 多功能酶标仪（美国Molecular Devices公司）；Mini PROTEAN 3 电泳及转膜装置（美国 BIO-RAD公司）。

1.1.2 药品与试剂 化合物NPBM、化合物NMBM（实验室合成经四大光谱确证结构）；氯硝柳胺（安徽东盛制药有限公司生产）；STAT-3、phosphor-STAT-3、Jak、Bcl-2、兔抗人Stat-3 抗体（一抗）及FITC标记羊抗兔IgG（二抗）均购自武汉博士德生物技术有限公司；培养液DMEM及McCoy's 5a、0.25%胰蛋白酶、PBS及DMSO购自上海吉诺医药生物技术有限公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；细胞固定用多聚甲醛由本实验室自行配制。

1.1.3 细胞 人肝癌HepG-2细胞购自中科院上海细胞库。

1.2 方法

1.2.1 MTT法检测化合物对肝癌细胞HepG-2增殖活性的影响 采用MTT法检测化合物NPBM和NMBM在不同浓度对肝癌细胞HepG-2的影响，并选用氯硝柳胺作为阳性对照药。取对数生长期的肝癌细胞HepG-2，分别以2×104个/mL细胞密度接种于96孔培养板中，100 μL/孔，每种细胞各种4块板。置于37 ℃，5% CO2孵箱内培养12 h。吸弃上清液，然后分别加入200 μL不同浓度的NPBM、NMBM。同时设阳性对照药组和不含药物的细胞对照组，每组设4个复孔。培养24 h后，再加入5 mg/mL的MTT 20 μL/孔，继续培养4 h后吸弃上清，加入DMSO 150 μL/孔，微振荡器上振荡10 min，将试剂对照调零，用自动酶标仪在570 nm波长处测出细胞对照组和各药物组的OD值，取各组均值，重复实验3次。以下面的公式计算各组药物对细胞的抑制率IR=（1-药物组OD值/细胞对照组OD值）×100%，同时计算IC50值。

1.2.2 荧光免疫试验 取对数生长期肝癌细胞HepG-2于24孔板中培养（约5×103/孔），培养24～48 h后（70%汇合度），加入预先配置好的不同浓度待测药物（1.0×10-4，3.3×10-5及1.0×10-5mol/L），经孵育24 h后，弃培养液，多聚甲醛溶液室温固定细胞15 min，PBS洗净后加入致孔剂Triton 100（浓度为0.3%），室温静置30 min，PBS洗净后封闭液（10%山羊血清）覆盖标本表面37 ℃孵育1 h，洗净后加一抗4 ℃孵育过夜，第2天37 ℃复温1 h，FITC标记二抗以合适浓度稀释于PBS，覆盖标本表面，37 ℃避光孵育1 h，加DAPI荧光试剂核染，5 min后PBS润洗三遍，于荧光显微镜下拍照记录。通过CCD成像系统读取绿色部分荧光强度。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17统计软件处理数据，多组间数据进行比较采用单因素方差（ANOVA）进行分析，实验数据进行比较，以P＜0.05为差异有显著性意义。利用Graph- Pad Prism 5.0软件进行实验数据相关图形的绘制。

2 结 果

2.1 化合物NPBM和NMBM对HepG-2肝癌细胞增殖活性影响情况 MTT法显示不同浓度化合物NPBM和NMBM及阳性对照药氯硝柳胺对肝癌细胞HepG-2的影响，结果如图1所示，不同浓度化合物NPBM和NMBM（1.56，3.12，6.25，12.5，25，50和100μmol/L）对肝癌HepG-2细胞的增殖均具有不用程度的抑制作用。氯硝柳胺、化合物NPBM和NMBM对HepG-2细胞logC分别为-4.627、-4.092、-4.314。

图1 化合物NPBM和NMBM对HepG-2的影响

2.2 化合物NPBM和NMBM对HepG-2肝癌细胞STAT-3表达的影响 荧光免疫实验显示化合物NPBM和NMBM对HepG-2肝癌细胞中STAT-3的表达具有一定的抑制作用（见图2），其中化 合 物NPBM浓 度 为10-4mol/L、3.3×10-5mol/L及10-5mol/L对HepG-2肝 癌 细 胞 中STAT-3表达总量均具有显著抑制作用，化合物NMBM浓度 为10-4mol/L及10-5mol/L对HepG-2肝 癌 细 胞中STAT-3表达总量具有轻度抑制作用，化合物NMBM浓度3.3×10-5mol/L对HepG-2肝癌细胞中STAT-3表达总量无抑制作用。

图2 化合物NPBM和NMBM对HepG-2肝癌细胞STAT-3表达的影响

3 讨 论

STAT-3蛋白与多种肿瘤的关系极为密切，STAT-3蛋白在超过70%的人类肿瘤中呈过度活化，主要通过调控促癌相关基因参与肿瘤细胞的异常增殖、侵袭转移、血管生成和免疫逃逸等过程[7-8]。近年来有研究表明，STAT-3可能与肝癌的发生早期阶段有一定关系，同时STAT的过度表达与肝癌的病理分期也呈正相关，阻断STAT-3的磷酸化可发挥抑制肝癌晚期肿瘤细胞的侵袭和转移能力，从而影响肝癌患者的预后及生存期[9]。

基于以上研究背景，本研究选取了前期合成的化合物NPBM和NMBM作用于HepG-2肝癌细胞，结果显示化合物NPBM和NMBM能够抑制HepG-2肝癌细胞的增殖，同时不同浓度的化合物NPBM对HepG-2肝癌细胞中STAT-3表达总量均具有显著抑制作用，化合物NMBM对HepG-2肝癌细胞中STAT-3表达总量抑制作用较轻。

综上所述，化合物NPBM和NMBM能够抑制肝癌细胞，作用机制可能与抑制STAT-3信号通路有关。