独活寄生颗粒治疗大鼠肩周炎的效果和作用机制研究

何文全，苏进益，陆红日，张洪彬，赖伟伟

（台州市中医院，浙江 台州 318001）

肩周炎是临床常见的关节疾病，多发生于50岁以上中老年人，患者多有长期劳作史或肩部外伤史。肩周炎的主要临床表现为肩关节持续疼痛和功能受限，严重影响患者的生活和工作。临床上治疗肩周炎的常用方法有药物口服、药物局部注射及关节镜下松解术，这些方法在一定程度上能够缓解临床症状，但分别存在不良反应较多、疗效持续时间短及具有创伤性等不足。肩周炎属于中医学“痹证”范畴，主要病机为气滞血瘀。中医临床采用祛风散寒、温经通络的治法治疗肩周炎，取得了良好的临床疗效。独活具有祛风除湿、散寒止痛之功，独活寄生颗粒以独活为主要成分，具有养血舒筋、祛风除湿的功效，常用于风寒湿痹所致腰膝冷痛、屈伸不利。为了探讨独活寄生颗粒治疗肩周炎的效果和作用机制，我们建立了大鼠肩周炎模型，并进行了相关动物实验，现总结报告如下。

1 材料与仪器

1．1 实验动物

无特定病原Sprague-Dawley大鼠50只，雄性，8月龄，体质量（400±20）g，购自上海灵畅生物科技有限公司[生产许可SCXK（沪）2018-0003]。

1．2 实验试剂

独活寄生颗粒（海南海力制药有限公司，国药准字Z20050053），放射免疫沉淀法（radioimmunoprecipitation assay，RIPA）裂解液（上海雅酶生物医药科技有限公司），脂多糖（上海源叶生物科技有限公司），肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素（interleukin，IL）-1β、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）酶联免疫吸附分析（enzyme linked immunoserbent assay，ELISA）试剂盒（上海酶联生物科技有限公司），二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量试剂盒（美国Thermo Fisher Scientific公司），兔抗大鼠 Toll样受体（Toll-like receptor，TLR）4、TLR2、髓样分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）、甘油醛 -3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）一抗及山羊抗兔免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）G二抗（美国Abcam公司）。

1．3 实验仪器

Varioskan LUX多功能酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司），DSX 100光学显微镜（日本Olympus株式会社），DYCZ-26C电泳仪（北京六一生物科技有限公司）。

2 方 法

2．1 模型建立方法

从50只大鼠中随机选取10只作为正常对照组，其余建立肩周炎模型：将大鼠仰卧位固定于台面上，右肩用眼科剪剪去毛发（面积3 cm×3 cm）。将右前肢远端以绷带固定于电动震荡器，以50次·min频率、1．5 cm振幅摇动，每天摇动5 h，持续摇动3 d。摇动过程中观察并及时调整震荡器角度，避免大鼠受伤。摇动结束后第1天，大鼠再次固定于台面上，将内装冰块的塑料袋外敷于大鼠右肩，每天冰敷5 h，持续冰敷3 d。冰敷过程中注意及时补充冰块。冰敷结束后，大鼠右侧肩关节活动受限，关节周围软组织可见轻度红肿、充血、部分瘀斑，表明肩周炎模型建立成功。

2．2 分组干预方法

将建模成功的大鼠随机分为肩周炎模型组、独活寄生颗粒干预组、独活寄生颗粒联合脂多糖干预组，独活寄生颗粒干预组每天按照3 g·kg独活寄生颗粒进行灌胃，独活寄生颗粒联合脂多糖干预组每天按照3 g·kg独活寄生颗粒、3 mg·kg脂多糖进行灌胃，均以生理盐水制成5 mL溶液；正常对照组和肩周炎模型组以5 mL生理盐水灌胃；每天灌胃1次，持续5周。

2．3 大鼠运动能力评价方法

干预结束后第1天，进行旷场实验：将大鼠置于上方安装全方位摄像头、体积80 cm×120 cm×100 cm的黑箱中央，记录大鼠3 min内的活动影像，计算并记录大鼠中央停留时间及活动总路程。注意将大鼠提前带入实验房间以适应环境，实验期间保持房间安静；每只大鼠实验结束后擦拭、消毒黑箱底面与内壁，避免气味残留对后续实验造成影响。

2．4 病理学检查方法

旷场实验结束后大鼠禁食禁水，12 h后于大鼠腹腔注射戊巴比妥钠深度麻醉，采用颈椎脱位法处死大鼠，于肩关节切取面积3 cm×3 cm的组织样本，并将其分成4份，1份用于组织病理学观察，3份于液氮中保存备用。取1份肩关节组织标本以4%多聚甲醛固定24 h，梯度酒精脱水、透明、浸蜡、包埋，切为厚度5μm的切片。用二甲苯脱蜡，无水乙醇冲洗后自来水冲洗30 s；苏木精染色液染色5 min，自来水冲洗；加入盐酸酒精分化液分化，自来水冲洗后反蓝；伊红染色液染色2 min，梯度乙醇脱水、透明；滴入中性树胶封片，采用光学显微镜观察组织病理变化。

2．5 炎症相关指标检测方法

取保存于液氮中的肩关节组织，充分剪碎后加入PBS，放入匀浆器中裂解组织和细胞。将匀浆倒入离心管中，于4℃下以10 000 r·min的转速（离心半径8 cm）离心15min，取上清液。按照ELISA试剂盒说明书，采用ELISA法检测肩关节组织中TNF-α、IL-1β、PGE2含量，酶标仪测定波长570 nm。采用标准曲线法计算样品中TNF-α、IL-1β、PGE2浓度。

2．6 疼痛相关指标检测方法

参照2．5中方法制备肩关节组织样品，按照ELISA试剂盒说明书，采用ELISA法检测肩关节组织中5-HT含量，酶标仪测定波长570 nm。采用标准曲线法计算样品中5-HT浓度。

2．7 炎症信号通路相关蛋白检测方法

取保存于液氮中的肩关节组织，充分剪碎后加入PBS，制成匀浆后加入RIPA裂解液，转移至离心管，以8000 r·min的转速（离心半径10 cm）离心20 min，取上清。采用BCA法测定蛋白浓度，调整样品蛋白浓度使蛋白上样量一致，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳结束后，将凝胶上的蛋白湿转至硝酸纤维素膜，5%脱脂牛奶封闭2 h，加入兔抗大鼠 TLR4、TLR2、MyD88一抗（1∶500），于 4℃摇床孵育 2 h，TBST洗膜，加入山羊抗兔IgG二抗（1∶2000），常温孵育2 h，TBST洗膜，加入发光液显色，采用凝胶成像系统进行拍照和分析。目标蛋白相对表达量＝目标蛋白灰度值／GAPDH灰度值。

2．8 数据统计方法

采用SPSS22．0统计软件对所得数据进行统计学分析。4组大鼠中央停留时间、活动总路程及肩关节组织中TNF-α含量、IL-1β含量、PGE2含量、5-HT含量、TLR4蛋白表达量、TLR2蛋白表达量、MyD88蛋白表达量的组间总体比较均采用单因素方差分析，组间两两比较均采用LSD-t检验；检验水准 α＝0．05。

3 结 果

3．1 模型建立及分组结果

建立肩周炎模型成功32只，肩周炎模型组10只、独活寄生颗粒干预组11只、独活寄生颗粒联合脂多糖干预组11只。

3．2 大鼠运动能力评价结果

4组大鼠中央停留时间、活动总路程比较，组间差异均有统计学意义。肩周炎模型组、独活寄生颗粒干预组、独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠的中央停留时间均长于正常对照组（LSD-t＝26．670，P＝0．000；LSD-t＝23．143，P＝0．000；LSD-t＝24．930，P＝0．000），活动总路程均短于正常对照组（LSD-t＝9．581，P＝0．000；LSD-t＝4．113，P＝0．001；LSD-t＝7．017，P＝0．000）；独活寄生颗粒干预组、独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠的中央停留时间均短于肩周炎模型组（LSD-t＝10．385，P＝0．000；LSD-t＝4．300，P＝0．000），活动总路程均长于肩周炎模型组（LSD-t＝5．878，P＝0．000；LSD-t＝2．984，P＝0．008）；独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠中央停留时间长于独活寄生颗粒干预组（LSD-t＝6．337，P＝0．000），活动总路程短于独活寄生颗粒干预组（LSD-t＝3．024，P＝0．000）。见表1。

表1 4组大鼠运动能力评价结果

3．3 病理学检查结果

HE染色结果显示，正常对照组大鼠肩关节肌细胞、肌纤维排列整齐，肌组织结构完整，未见增生的毛细血管及炎性细胞；肩周炎模型组大鼠肩关节肌细胞、肌纤维排列混乱，肌组织结构不完整，可见大量增生的毛细血管及炎性细胞；独活寄生颗粒干预组、独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠肩关节肌细胞、肌纤维排列及肌组织结构较肩周炎模型组有所改善，增生的毛细血管及炎性细胞较肩周炎模型组少，且独活寄生颗粒干预组大鼠肩关节肌细胞、肌纤维排列及肌组织结构改善程度大于独活寄生颗粒联合脂多糖干预组，增生的毛细血管及炎性细胞少于独活寄生颗粒联合脂多糖干预组。见图1。

图1 4组大鼠肩关节组织病理学检查结果（HE染色，×100）

3．4 炎症相关指标检测结果

4组大鼠肩关节组织中TNF-α、IL-1β、PGE2含量比较，组间差异均有统计学意义。肩周炎模型组、独活寄生颗粒干预组、独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠肩关节组织中TNF-α、IL-1β、PGE2含量均高于正常对照组（TNF-α：LSD-t＝12．958，P＝0．000；LSD-t＝8．145，P＝0．000；LSD-t＝10．245，P＝0．000；IL-1β：LSD-t＝8．389，P＝0．000；LSD-t＝5．126，P＝0．000；LSD-t＝9．652，P＝0．000；PGE2：LSD-t＝14．044，P＝0．000；LSD-t＝12．365，P＝0．000；LSD-t＝8．335，P＝0．000）；独活寄生颗粒干预组、独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠肩关节组织中TNF-α、IL-1β、PGE2含量均低于肩周炎模型组（TNF-α：LSD-t＝6．901，P＝0．000；LSD-t＝5．746，P＝0．000；IL-1β：LSD-t＝5．528，P＝0．000；LSD-t＝16．352，P＝0．000；PGE2：LSD-t＝6．932，P＝0．000；LSD-t＝12．687，P＝0．000）；独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠肩关节组织中TNF-α、IL-1β、PGE2含量均高于独活寄生颗粒干预组（LSD-t＝2．944，P＝0．008；LSD-t＝2．954，P＝0．008；LSD-t＝2．666，P＝0．015）。见表2。

表2 4组大鼠肩关节组织炎症相关指标检测结果

3．5 疼痛相关指标检测结果

4组大鼠肩关节组织中5-HT含量比较，差异有统计学意义[（152．14±24．73）ng·mL，（219．58±29．20）ng·mL，（180．33±21．37）ng·mL，（201．44±25．49）ng·mL，F＝13．301，P＝0．000]。肩周炎模型组、独活寄生颗粒干预组、独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠肩关节组织中5-HT含量均高于正常对照组（LSD-t＝6．813，P＝0．000；LSD-t＝2．802，P＝0．011；LSD-t＝4．489，P＝0．000）；独活寄生颗粒干预组、独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠肩关节组织中5-HT含量均低于肩周炎模型组（LSD-t＝4．892，P＝0．000；LSD-t＝2．777，P＝0．012）；独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠肩关节组织中5-HT含量高于独活寄生颗粒干预组（LSD-t＝2．105，P＝0．048）。

3．6 炎症信号通路相关蛋白检测结果

4组大鼠肩关节组织中TLR4、TLR2、MyD88蛋白表达量比较，组间差异均有统计学意义。肩周炎模型组、独活寄生颗粒干预组、独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠肩关节组织中TLR4、TLR2、MyD88蛋白表达量均高于正常对照组（TLR4：LSD-t＝30．840，P＝0．000；LSD-t＝23．541，P＝0．000；LSD-t＝21．147，P＝0．000；TLR2：LSD-t＝23．667，P＝0．000；LSD-t＝26．985，P＝0．000；LSD-t＝29．654，P＝0．000；MyD88：LSD-t＝26．787，P＝0．000；LSD-t＝30．142，P＝0．000；LSD-t＝25．333，P＝0．000）；独活寄生颗粒干预组、独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠肩关节组织中TLR4、TLR2、MyD88蛋白表达量低于肩周炎模型组（TLR4：LSD-t＝26．409，P＝0．000；LSD-t＝20．145，P＝0．000；TLR2：LSD-t＝21．264，P＝0．000；LSD-t＝19．874，P＝0．000；MyD88：LSD-t＝20．393，P＝0．000；LSD-t＝22．987，P＝0．000）；独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠肩关节组织中TLR4、TLR2、MyD88蛋白表达量均高于独活寄生颗粒干预组（LSD-t＝12．603，P＝0．000；LSD-t＝18．770，P＝0．000；LSD-t＝17．428，P＝0．000）。见表3、图2。

表3 4组大鼠肩关节组织炎症信号通路相关蛋白检测结果

图2 4组大鼠肩关节组织炎症信号通路相关蛋白检测结果

4 讨 论

肩周炎是一种肩关节周围软组织无菌性炎症，主要临床表现为肩关节的持续疼痛和活动障碍。激素、外伤、长期劳作等均是肩周炎发生的危险因素。组织病理学检查显示，肩周炎的病变部位累及肩关节关节囊、滑膜、韧带及肌腱，关节囊呈现明显挛缩、滑膜呈现纤维化。肩周炎属于中医学“痹证”范畴，其主要病因病机为急慢性劳损而致气滞血瘀，故治疗应以祛风散寒、温经通络为主。独活味苦、辛，性微温，具有祛风寒湿邪、解表止痛等功效，是中医常用的祛风通络药物。独活中含有的异欧前胡素、蛇床子素、β-谷甾醇等有效成分均具有抗氧化、抗炎、镇痛等作用。Xu等研究发现，蛇床子素能通过抑制体内炎症反应和细胞应激，发挥治疗关节炎的作用。独活寄生颗粒以独活为主要有效成分，主要用于风寒湿痹所致腰膝冷痛，屈伸不利。乙军等分别采用独活寄生颗粒联合塞来昔布（试验组）和塞来昔布（对照组）治疗膝骨性关节炎，结果显示治疗后30 d试验组患者临床症状显著改善，且超敏C反应蛋白、IL-1、IL-6、TNF-α血清含量均低于对照组，提示独活寄生颗粒具有一定的抗炎、镇痛作用。本研究采用独活寄生颗粒治疗大鼠肩周炎，以大鼠运动能力评价独活寄生颗粒改善肩周炎症状的效果。旷场实验是基于大鼠因对陌生环境畏惧而沿墙壁活动的天性设计的经典动物实验，该实验通过大鼠的中央停留时间和活动总路程反映大鼠的运动能力：中央停留时间越短、活动总路程越长表明大鼠运动能力越强。本研究结果显示，独活寄生颗粒干预组大鼠的中央停留时间短于肩周炎模型组、活动总路程长于肩周炎模型组，提示独活寄生颗粒能够改善肩周炎大鼠的疼痛等症状，从而提高其运动能力。肩关节组织中TNF-α、IL-1β、PGE2含量能够反映组织炎症水平；5-HT属于抑制性神经递质，病变组织释放5-HT，通过激活不同的5-HT受体参与机体疼痛感觉的传递。华浩昌等采用激痛点推拿配合关节松动手法治疗肩周炎气滞血瘀证患者，结果显示患者疼痛显著缓解，且治疗后5-HT血清含量显著降低。本研究结果显示，独活寄生颗粒干预组大鼠肩关节组织中 TNF-α、IL-1β、PGE2及5-HT含量均低于肩周炎模型组，提示独活寄生颗粒能够发挥降低炎症反应、改善疼痛的作用。

TLR／MyD88信号通路是机体重要的炎症反应信号通路之一。Lopez-Bergami等研究发现，在骨髓单核细胞中激活TLR／MyD88信号通路，能够抑制抗炎细胞因子IL-10的合成，引发炎症反应。TLR主要在巨噬细胞、树突状细胞的表面表达，是一种抗原识别受体，能够识别内源性和外源性配体。TLR在受到抗原刺激后能够激活下游MyD88，再通过细胞内信号传导激活核因子-κB，诱导巨噬细胞释放IL-6、TNF-α、IL-1β等炎症因子。本研究结果显示，肩周炎模型大鼠肩关节组织中 TLR4、TLR2、MyD88蛋白表达量较正常组显著提高，而采用独活寄生颗粒干预后大鼠肩关节组织中TLR4、TLR2、MyD88蛋白表达量显著降低。脂多糖是TLR／MyD88信号通路的激活剂，独活寄生颗粒联合脂多糖干预组大鼠肩关节组织TLR4、TLR2、MyD88蛋白表达量均高于独活寄生颗粒干预组，表明脂多糖在一定程度上能够抑制独活寄生颗粒的治疗作用，也提示独活寄生颗粒治疗大鼠肩周炎的作用机制与抑制TLR／MyD88信号通路相关蛋白的表达有关。

本研究结果表明，采用独活寄生颗粒治疗大鼠肩周炎，能够缓解疼痛、抑制炎症反应，其作用机制可能与抑制TLR／MyD88信号通路相关蛋白的表达有关。