不同品种香菇子实体游离氨基酸组成的主成分分析及综合评价

刘 芹，特日根，师子文，吴 杰，胡素娟，崔 筱，孔维丽

（1. 河南省农业科学院 植物营养与资源环境研究所，河南 郑州 450002；2. 内蒙古农业大学 内蒙古农牧渔业生物实验研究中心，内蒙古 呼和浩特 010019；3. 河南农业大学 生命科学学院，河南 郑州 450002）

香菇（Lentinus edodes）又名香菌、香蕈、香菰、冬菇、香信等，是我国传统种植的食用菌品种，深受消费者的喜爱[1]。香菇香气浓郁，滑嫩鲜美，具有丰富的营养价值和特殊的医疗保健价值，长期食用能起到防病健身的作用[2‑4]。据中国食用菌协会统计，2020 年我国香菇年产量高达1 188.21 万t，比2019年增加72.26 万t，增长6.48%[5]。河南省香菇种植面积和年产量均居全国第一，以豫西伏牛山区为主，香菇产业已成为河南省助力乡村振兴的主要抓手[6]。游离氨基酸是一类非蛋白质氨基酸，占氨基酸总量的25%～35%，是食物味觉活性的重要组成部分[7]。游离氨基酸根据其呈味特征可分为4个类别：甜味、鲜味、苦味和芳香族氨基酸。甜味氨基酸包括丙氨酸（Ala）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、脯氨酸（Pro）和组氨酸（His）；鲜味氨基酸包括谷氨酸（Glu）、天冬氨酸（Asp）和赖氨酸（Lys）；苦味氨基酸包括精氨酸（Arg）、缬氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）和色氨酸（Trp）；芳香族氨基酸包括苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）[8]。游离氨基酸是香菇中重要的味觉活性物质，尤其是Asp 和Glu，是香菇鲜味的主要来源[3]。目前，香菇研究主要集中在采后生理变化、活性物质的分离纯化及活性评价、保鲜技术等方面，关于氨基酸的分析主要是组成和含量测定及方法学研究，而关于香菇不同品种间的氨基酸差异性分析鲜见报道[9]。

主成分分析（PCA）是一种通过数据降维技术把多个变量化为少数几个主成分的多元统计方法[7，10‑16]。目前此方法已被广泛应用于农产品综合品质评价和特征性评价指标的筛选。LI 等[17]利用PCA 对不同培养基栽培的香菇品质进行综合评价，发现C/N 高的培养基获得的香菇口感较好，且该评价方法和传统感觉评价结果一致。SUN 等[18]采用PCA发现野生食用菌特征性游离氨基酸的含量高低与食用菌特征风味的形成直接相关。王馨雨等[19]通过PCA实现对不同品种百合及其内外鳞茎中游离氨基酸的综合评价，可为百合分级加工和品种选育提供参考。本研究拟对河南省常规栽培的14个香菇品种的游离氨基酸组成及含量进行检测分析，并比较呈味氨基酸的味道强度值（TAV），采用PCA 法和聚类分析法进行综合评价，旨在为香菇品种选育和产品的开发、营养价值与特征风味的研究提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

供试香菇品种农香1 号、农香3 号、香28、香9608、香1024、香808、香931、香LS、L18、雨花3 号、韩香1 号、南山1 号、香25、豫香1 号均保藏于河南省食用菌种质资源库。栽培试验于2021 年2—10月在河南省农业科学院河南现代农业研究开发基地进行。待香菇子实体长至八成熟时采收，采收后的子实体样品用保鲜袋分装，再放入加有冰块的泡沫箱，运回实验室后统一采用冷冻干燥机干燥至恒定质量。

氨基酸混合标准品、茚三酮购自美国Sigma 公司；盐酸、磺基水杨酸（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器

VFD-2000A 冷冻干燥机（上海比朗仪器设备制造有限公司）、高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）、KQ-数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、L-8900氨基酸自动分析仪（日本Hitachi公司）。

1.3 方法

参考LIU 等[3]的方法，称取1.0 g 香菇冻干粉加入10 mL 的100 mmol/L 盐酸中，在25 ℃超声提取30 min。5 000×g离心10 min后，取5.0 mL 上清液与5 mL 5.0%磺基水杨酸混合，25 ℃黑暗静置30 min。5 000×g离心10 min，收集上清液并采用微孔过滤膜（0.22 μm）过滤。采用氨基酸自动分析仪（L8900，Hitachi，日本）对滤液进行测定和分析。采样前对氨基酸混合标准品进行分析，通过比对样品的氨基酸峰谱和标准氨基酸谱，对样品中的氨基酸进行鉴定和定量。结果用每克干质量所含氨基酸的毫克数（mg/g）表示。每份样品重复检测3 次，测定结果取平均值。

1.4 数据分析

1.4.1 数据统计 试验数据采用Excel 2016软件进行统计分析，计算平均值并绘制雷达图。采用R 语言进行热图和PCA 图绘制。采用IBM SPSS Statistics 23.0软件对试验数据进行单因素方差分析（Analysis of variance，ANOVA），差异显著性分析采用Duncan’s multiple range tests，P<0.05 表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

1.4.2 TAV 分析 TAV 是样品中呈味物质测定值与其味觉阈值的比值[20]。若TAV>1，则认为该物质对呈味有贡献；若TAV<1，则认为该物质对呈味贡献较小。由此确定香菇中的重要呈味氨基酸[7]。

1.4.3 适应性检验 采用IBM SPSS Statistics 23.0进行相关系数分析，相关系数的大小可直接反映原始变量之间线性相关程度[20]。

1.4.4 PCA 分析及综合评价 采用IBM SPSS Statistics 23.0 软件进行PCA 分析，比较不同香菇品种中游离氨基酸的差异，得到原始数据相关系数矩阵的特征值、方差贡献率、成分矩阵及成分得分系数矩阵等，抽取特征值大于1.00 的因子作为主成分。利用主成分信息对香菇进行综合评价，以每个主成分所对应特征值的方差贡献率β（ii=1，2，3，…，k）为权重，由各主成分得分Fi与对应的权重相乘得综合评价模型：F=β1F1+β2F2+…+βkFk[7，19]。

1.4.5 聚类分析 根据14 个香菇样品中游离氨基酸组成及含量测定结果，采用IBM SPSS Statistics 23.0进行聚类分析，聚类方法为Ward最小方差和欧氏距离法，用树形图表示不同香菇品种品质的亲疏程度。

2 结果与分析

2.1 游离氨基酸含量与组成的差异

香28、香1024、香808、L18、韩香1号、南山1号、香25 和豫香1 号8 个品种均含有17 种游离氨基酸；其余6 个品种未检测到Trp，均含有16 种游离氨基酸。14 个香菇品种所检测到的游离氨基酸组成和含量如图1所示，中部填充颜色从蓝至红，表示氨基酸含量由低至高。Glu 和Asp 含量均明显高于其他氨基酸，这一结果与前期研究结果类似[3]，Trp 含量最低或没有检测到。从总游离氨基酸含量（TFAA）来看（图2），14 个香菇品种游离氨基酸总含量变化范围为10.91～20.57 mg/g，结果与LI等[17]的研究结果接近，其测定的香菇氨基酸含量在14.24～21.63 mg/g。其中，豫香1 号（20.57 mg/g）游离氨基酸总量最高，香1024（17.92 mg/g）、南山1 号（17.90 mg/g）和农香1号（17.61 mg/g）次之，农香3 号（10.91 mg/g）含量最低。由此可见，14个香菇品种中游离氨基酸的差异主要体现在含量而非种类上。

图1 不同品种香菇游离氨基酸比较Fig.1 Comparison of free amino acids in different shiitake mushrooms varieties

世界卫生组织（WHO）和联合国粮农组织（FAO）提出的蛋白质营养价值必需氨基酸模式为：理想蛋白质中必需氨基酸/（必需氨基酸+非必需氨基酸）[EAA/（EAA+NEAA）]值应达到40%左右；且必需氨基酸/非必需氨基酸（EAA/NEAA）值应在60%以上[21]。从图2 可以看出，14 个香菇品种EAA/（EAA+NEAA）值为30.87%～39.61%，EAA/NEAA 值为44.65%～65.61%，均接近或超过FAO/WHO 所推荐的理想蛋白质指标，尤其是豫香1 号游离氨基酸组成和含量最为符合。

图2 不同品种香菇游离氨基酸的组成及含量Fig.2 Composition and content of free amino acids in different shiitake mushrooms varieties

2.2 游离氨基酸呈味特征和TAV差异

游离氨基酸是食材中的主要呈味基础物质之一，食材的风味口感与其呈味氨基酸的含量和比例密切相关[22]。由图3 和表1 可知，14 个香菇样品的共同点是鲜味氨基酸含量最高，甜味和苦味氨基酸含量次之，芳香族氨基酸含量最低。农香1号（8.80 mg/g）、香1024（8.68 mg/g）、南山1号（8.82 mg/g）和豫香1 号（7.73 mg/g）中鲜味氨基酸含量最高，均在7 mg/g 以上。豫香1 号中甜味氨基酸、苦味氨基酸和芳香族氨基酸含量均最高，而农香3 号中此3 类氨基酸含量均最低。Phe和Tyr属于芳香族氨基酸，为人体的必需氨基酸，主要存在于乳制品和肉制品中，香菇中含有较少的芳香族氨基酸[19]。食用菌的鲜美滋味是由不同呈味游离氨基酸之间的平衡及相互影响决定的，对食用菌风味具有重要作用[21]。

表1 不同品种香菇游离氨基酸TAV值Tab.1 Taste active values of free amino acids in different shiitake mushrooms varieties

图3 不同品种香菇游离氨基酸呈味特性雷达图Fig.3 Radar chart of taste values of free amino acids in different shiitake mushrooms varieties

香菇品种间的呈味氨基酸含量差异显著，但是不同氨基酸对食材风味的贡献还与其味觉阈值直接相关，因此，采用TAV 对香菇各呈味氨基酸进行分析和比较。一般认为，TAV 越大，表示该呈味物质对食材的呈味贡献越大[19]。由表1 可知，14 种香菇品种中Glu、Asp、Lys、Ala、His、Arg和Val的TAV均大于1。鲜味氨基酸中，贡献最大的是Glu，其次是Lys 和Asp，值得一提的是，Glu 的TAV（9.29～20.06）是17种呈味氨基酸中的最高值。Glu 和Asp 是味精样成分，能呈现出较强的鲜味，Glu 的呈味阈值较小（0.3 mg/g），因而其鲜味最强[23]。甜味氨基酸不仅能掩盖苦涩味，同时能与鲜味氨基酸协同作用，起到增香增鲜的效果[7，24]。Ala 和His 等甜味氨基酸可表现出舒适的甜味，且其在14 个香菇品种中的TAV均大于1，对香菇风味的贡献较大。14 个香菇品种苦味氨基酸种类较多，且Arg 和Val 的TAV 大于1，这与HOU 等[8]的研究结果一致，即采用电子舌检测香菇时会呈现出一定的苦味信号。其他苦味氨基酸的TAV均小于1，但这不一定为劣势，因为当苦味氨基酸（如Ile、Trp等）含量低于呈味阈值时，可有效增强其他呈味氨基酸的呈味效果[19]。豫香1 号中大于味觉阈值的呈味氨基酸数量最多（9 个），除上述呈味氨基酸外，Met和Ile的TAV 亦大于1，从而赋予豫香1号更为丰富的口感。

2.3 游离氨基酸相关性分析

对14 个香菇品种含有的17 种游离氨基酸组分进行相关性分析，结果如表2 所示。各氨基酸之间有正相关也有负相关，且绝大部分呈显著正相关。鲜味氨基酸中，Asp 与Glu 呈显著正相关（P<0.05），而Lys 与Asp、Glu 均呈极显著正相关（P<0.01）。甜味氨基酸中，Thr、Ser、Gly、His 两两之间均有极显著相关性（P<0.01）。苦味氨基酸中，Val、Met、Ile、Leu两两之间均呈极显著正相关（P<0.01）。同时，甜味氨基酸Thr、Pro、Gly、His 与苦味氨基酸Val、Ile、Leu之间均呈极显著正相关（P<0.01）。芳香族氨基酸Phe 与Tyr 之间呈显著正相关关系（P<0.05）。以上结果说明，香菇游离氨基酸之间具有较强的相关性，可通过主成分分析对不同香菇品种进行综合评价。

表2 不同品种香菇游离氨基酸指标间相关性分析Tab.2 Correlation analysis of free amino acids in different shiitake mushrooms varieties

2.4 游离氨基酸的PCA分析

由表3 可知，由于前2 个主成分对应特征值均大于1，累计贡献率为94.11%，基本反映了所有变量的初始信息，故选取前2个主成分，反映不同香菇品种游离氨基酸的大部分信息。

表3 主成分的特征值和贡献率Tab.3 Eigenvalues of principal components and their contribution rate

因子载荷值反映香菇各氨基酸指标对主成分载荷的相对大小和影响的方向，数值反映原变量对因子影响的大小，正负代表变化方向的差别[20]。如表4所示，第1主成分（PC1）载荷较高的氨基酸指标包括Thr、Val、Ile、Leu、Phe、Lys、Asp、Gly、Pro、His、Ala，载荷值均大于0.8，为高度正相关。第2 主成分（PC2）Glu 载荷较高（0.76）且为正相关，Tyr（-0.65）、Trp（-0.60）和Met（-0.60）次之，为负相关。由此可知，第1 和第2 主成分反映了游离氨基酸的绝大部分信息，包括了5 种甜味氨基酸、5 种苦味氨基酸和全部的鲜味、芳香族氨基酸。

表4 主成分的特征向量与载荷矩阵Tab.4 Principal component eigenvectors and loading matrix

由图4 可知，14 个香菇样品具有较好的区分度，且数据点均置于95%置信区间内。大部分品种位于第四象限且聚集较好，说明其含有的游离氨基酸成分和含量相近；农香3 号位于第四象限但远离其他品种，说明其游离氨基酸成分组成和含量与其他品种差异较大；南山1号、农香1号和香1024位于第二象限且聚在一起，Glu、Ser 和Arg 对其区分具有较大的贡献；豫香1 号位于第三象限，Ile、Val、Leu、Pro、Ala、Met、Tyr、Tro 含量较高，对其分布均有较大的作用。

图4 不同品种香菇的PCA二维图Fig.4 PCA bi-plot for different shiitake mushrooms varieties

2.5 游离氨基酸的综合评价

由于主成分中前2 个组分反映了香菇样品中17 种游离氨基酸信息的94.11%，因此，利用前2 个组分进行不同品种游离氨基酸的综合评价是可行的[25]。利用PCA 得到的F1和F2两个新的综合指标代替原来的17 个指标对香菇中的游离氨基酸进行分析，得到前2个主成分线性关系分别为：

F1=0.07X1+0.07X2+0.06X3+0.08X4+0.07X5+…+0.06X16+0.07X17；

F2=0.05X1-0.06X2-0.19X3-0.05X4-0.08X5+…+0.18X16-0.08X17。

2 个主成分从不同方面反映了不同品种香菇中游离氨基酸的总体水平，单独使用某一个主成分并不能对其质量做出综合性评价，因此以每个主成分对应的方差相对贡献率作为权重，对2 个主成分得分进行权重加和，建立综合评价函数F=0.807F1+0.193F2，计算各品种的综合得分，分数高低可反映不同品种香菇游离氨基酸的综合品质高低。各品种香菇综合品质从高至低的排序为：豫香1 号、香1024、南山1 号、农香1 号、香25、香LS、香28、雨花3号、L18、香808、香9608、香931、韩香1号、农香3号（表5）。整体来看，14 个香菇品种中，豫香1 号综合得分最高，为6.78，并且显著高于其他品种（P<0.05），说明其游离氨基酸综合质量较高。农香3号的综合得分最低，为-4.09，其综合品质较差。

表5 不同品种香菇主成分得分和综合评价Tab.5 Principal component scores and comprehensive assessment of different shiitake mushrooms varieties

续表5 不同品种香菇主成分得分和综合评价Tab.5（Continued） Principal component scores and comprehensive assessment of different shiitake mushrooms varieties

2.6 聚类分析

根据14 个香菇样品的全部游离氨基酸组分进行聚类分析，采用欧氏距离和Ward 最小方差法进行系统聚类。由图5 可知，聚类结果与PCA 结果具有很大的一致性，14 个香菇品种聚成4 大类（欧氏距离=2.5）：第1 类为豫香1 号，品质最好，除Ser、Arg、Glu、His 外，其余氨基酸含量均为14 个品种中最高；第2 类为农香1 号、南山1 号和香1024，品质较好，其鲜味化合物Glu、甜味化合物Ser 及苦味氨基酸Arg 的含量最高；第3 类包括香25、香LS、香28、雨花3 号、L18、香808、香9608、香931、韩香1号，游离氨基酸含量比较低；第4 类是农香3 号，各氨基酸含量最低，品质相对最差。本试验是统一种植的，排除了氨基酸品质受种植区域环境（土壤、气温）及栽培技术等因素的影响，较好地反映出香菇不同种质间的差异性，因此，本试验结果可以为地方特色香菇品种的引种推广、开发利用及氨基酸营养价值评价提供良好参考。

图5 不同品种香菇聚类分析结果Fig.5 Cluster analysis of different shiitake mushrooms varieties

3 结论与讨论

香菇营养丰富，风味独特，为更好开发利用香菇的种质资源，发挥地方品种资源优势，开展不同品种香菇游离氨基酸营养成分分析和综合评价，筛选主要的滋味活性物质，建立了综合品质评价模型，为香菇品种选育和产品开发提供理论依据和评价方法。

本研究对河南省常规栽培的14 个香菇品种中游离氨基酸的组成及含量进行分析和评价。香菇中含有丰富的游离氨基酸，共检测到17 种氨基酸，含量为10.91～20.57 mg/g，高于已报道的红枣（1.753～4.947 mg/g）[25]、芡实（0.98 mg/g）[26]、克氏原螯虾（4.784～8.835 mg/g）[27]等农产品。从单个游离氨基酸所占的最大和最小比例看出，14个香菇品种中各游离氨基酸的比例较均衡，从另外2 个指标也可以看出食用菌类的游离氨基酸比例最为理想。一是FAO/WHO 提出必需氨基酸/（必需氨基酸+非必需氨基酸）理想值为40%，14 个香菇品种该值均接近40%；二是必需氨基酸/非必需氨基酸理想值为60%以上，14 个香菇品种该值也均接近或大于60%，尤其是豫香1 号游离氨基酸组成和含量最为符合。该结果与段静怡等[21]的研究结果一致，食用菌是优质的蛋白质来源。

大多数食用菌有独特的鲜美味道，与其所含的呈味物质有密切关系，而游离氨基酸中有很大一部分属于呈味氨基酸，其对食材的口感风味有很大贡献度[21，28‑29]。不同香菇品种呈味氨基酸组成模式一致，鲜味氨基酸含量最高，甜味和苦味氨基酸含量次之，芳香族氨基酸含量最低。豫香1号甜味、苦味及芳香族氨基酸含量均最高。Glu 对香菇风味的影响最大，TAV 在9.29～20.06，属于鲜味氨基酸，有效增加香菇的鲜美口味。通过主成分分析从17 种游离氨基酸中提取到2 个主成分，累计方差贡献率为94.11%，较好地反映香菇游离氨基酸品质的综合信息，并建立综合评价模型：F=0.807F1+0.193F2，计算得到不同品种香菇游离氨基酸综合评价得分，得分越高反映该品种香菇游离氨基酸综合品质越好。14 个香菇品种得分从高至低分别为：豫香1 号、香1024、南山1 号、农香1 号、香25、香LS、香28、雨花3号、L18、香808、香9608、香931、韩香1 号、农香3号。豫香1 号品质最好，农香3 号品质相对最差。采用聚类分析将14 个香菇品种分为4 类，结果与主成分分析结果一致，较好地反映香菇不同种质间的差异性。

综上所述，本试验统一种植，排除了土壤、营养袋、种植模式及栽培技术等因素影响，较好地反映了品种间游离氨基酸的差异性，因此可以为香菇优良品种筛选及产品的开发利用提供相应的理论依据。