益生菌复合配方对小鼠肠道功能的影响

汪家琦 康文丽 吴忠坤 唐溶雪 彭 灿 戴智勇 董 玲 潘丽娜

(1. 澳优乳业〔中国〕有限公司，湖南 长沙 410127; 2. 湖南澳优食品与营养研究院，湖南 长沙 410299; 3. 人体微生态制品湖南省工程研究中心，湖南 长沙 410017;4. 锦乔生物科技有限公司，江苏 淮安 223005)

常见胃肠道疾病如便秘、腹泻和炎症性肠病等胃肠道疾病严重影响人们的生活质量。益生菌是一类对宿主有益的活的微生物，具有维持肠道内环境稳态，抑制有害菌的生长，调节肠道微生物组成，增强机体免疫力等作用[1-2]。有研究[3]发现，益生菌的摄入能有效调节肠道菌群，降低pH，增强小肠蠕动，改善便秘。益生菌制剂对维持肠道菌群紊乱，提高肠道菌群的定殖能力具有显著效果[4-5]。

研究拟通过构建盐酸洛哌丁胺诱导的功能性便秘、DSS诱导的肠黏膜损伤、抗生素诱导的腹泻3种模型，探究益生菌复合配方对小鼠小肠墨汁推进率、排便情况、肠黏膜组织切片、肠黏膜损伤评分、腹泻评分等指标的影响，为推动益生菌复合配方工业化生产，应用于肠道疾病的合理有效性提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

萃可舒益生菌复合配方：具体成分为乳双歧杆菌CP-9(BifidobacteriumlactisCP-9)、婴儿双歧杆菌BLI-02(BifidobacteriuminfantisBLI-02)、短双歧杆菌BV-889(BifidobacteriumbreveBV-889)、鼠李糖乳杆菌MP-108(LactobacillusrhamnosusMP-108)、嗜热链球菌SY-66(StreptococcusthermophilusSY-66)，辅料为低聚半乳糖、低聚乳糖、麦芽糊精、乳糖醇，澳优乳业(中国)有限公司；

盐酸洛哌丁胺：美国Selleck公司；

阿拉伯树胶：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

活性碳粉：型号为10006619，国药集团化学试剂有限公司；

硫酸葡聚糖钠(DSS)：北京酷来搏科技有限公司；

硫酸庆大霉素注射液：2 mL，8万单位/支，批号 5120106，上海现代哈森(商丘)药业有限公司；

头孢拉定胶囊：0.25 g/粒，批号110804，广州白云山医药集团股份有限公司；

其他试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

显微镜：SG50-2A43L-A型，苏州神鹰光学有限公司；

组织切片机：McIlwain型，上海玉研科学仪器有限公司；

超净工作台：BBS-SDC型，济南鑫贝西生物技术有限公司；

灭菌锅：LMQ.C型，山东新华医疗器械股份有限公司；

高速冷冻离心机：5810R型，德国艾本德股份公司。

1.2 试验动物

健康雄性BALB/c小鼠300只，体重18～22 g，伦理审核编号为JN.No20190530b3000730，饲养于江南大学动物中心，SPF级屏障环境，来源于北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.3 便秘模型

益生菌复合配方人体推荐用量为6 g/d，以人体摄入量的1，10，30倍，设低、中、高3个剂量组(活菌数分别为1.5×108，1.5×109，4.5×109CFU)，1个空白对照组和1个模型对照组，每组15只动物，灌胃量为0.2 mL/只，且每2 d调整灌胃量，具体试验安排及分组见表1。

表1 便秘模型小鼠试验安排及分组情况Table 1 Trial arrangement of mouse constipation model

1.3.1 墨汁推进率测定 通过灌胃药物洛哌丁胺，建立小鼠便秘模型，计算一定时间内小肠的墨汁推进率，来判断模型小鼠胃肠蠕动功能[6]。给药洛哌丁胺0.5 h后，低、中、高剂量组分别给予含受试样品的墨汁(含5%活性炭粉、10%阿拉伯树胶)，空白对照组和模型对照组小鼠给予墨汁灌胃。25 min后立即脱颈椎处死动物，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，置于托盘上，轻拉成直线，测量肠管长度为小肠总长度，从幽门至墨汁前沿为墨汁推进长度[7]。并按式(1)计算墨汁推进率。

(1)

式中：

M——墨汁推进率，%；

L1——墨汁推进长度，cm；

L——小肠总长度，cm。

1.3.2 排便时间、粪便粒数和粪便重量测定 通过测定小鼠首次排黑便时间和6 h内排便粒数和排便重量，分析模型小鼠的排便情况[8]。通过灌胃不同浓度的益生菌复合配方，测定益生菌复合配方的肠道调节作用及对便秘的缓解作用[9-10]。

1.4 肠黏膜损伤模型

通过饮水给予3%硫酸葡聚糖，建立小鼠肠黏膜损伤模型，观察肠黏膜病理组织学改变，以此判断模型小鼠肠黏膜损伤情况[11]。通过灌胃不同浓度的益生菌复合配方，观察其对肠黏膜的保护作用。具体试验分组情况见表2。

表2 肠黏膜损伤小鼠试验安排及分组情况Table 2 Trial arrangement of mouse intestinal mucosal damage model

1.4.1 大便情况疾病活动度(DAI)评分 检测各组小鼠大便情况疾病活动度，分析各组的病症情况，具体评分细则见表3。

表3 大便情况疾病活动度(DAI)评分细则Table 3 Disease activity index (DAI) of mice stool

1.4.2 苏木精—伊红(HE)染色及肠黏膜损伤评价 给予受试样品13 d后，剪取盲肠末端至肛门的完整结肠、直肠肠管，观察各组小鼠结肠变化，测量结肠长度和重量并制作石蜡切片，进行HE染色后观察病理组织学变化，并按Chiu肠黏膜损伤评分表(表4)进行评分[12-13]。

表4 Chiu肠黏膜损伤评分表Table 4 Chiu intestinal mucosal damage score

1.5 腹泻模型

采用混合抗生素造成菌群紊乱引起的腹泻模型，给予受试样品并观察小鼠腹泻症状及肠黏膜的改变，由此判断受试样品对小鼠腹泻的影响作用[14]。小鼠灌胃混合抗生素主要是由硫酸庆大霉素注射液和头孢拉定胶囊组成，将硫酸庆大霉素注射液和头孢拉定胶囊用无菌生理盐水配成质量浓度为62.5 g/L的抗生素混合液[15]，造成小鼠体内菌群紊乱进而引起腹泻。通过灌胃不同浓度的益生菌复合配方，研究益生菌复合配方对肠黏膜损伤和腹泻症状的改善作用，具体的小鼠试验方案见表5，观察每组病理组织学、肠黏膜损伤评分及腹泻情况。

表5 腹泻小鼠试验安排及分组情况Table 5 Trial arrangement of mouse diarrhea model

每天观察并记录小鼠形态行为、活动及排便情况，并按照Akinobu Kurita腹泻评分表进行评分[16]。0分：大便正常或没有；1分：轻度腹泻，大便可见轻微湿软；2分：中度腹泻，大便较湿且不成型，并有轻度肛周着色；3分：重度腹泻，水样便并伴有重度肛周着色。停药24 h后出现的腹泻为迟发性腹泻。

1.6 数据处理

采用SPSS 22.0统计软件进行分析[17]。对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换再进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。字母不同表示差异显著(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 益生菌复合配方对小鼠便秘的影响

2.1.1 对小肠墨汁推进率的影响 由表6可知，与空白组相比，模型组墨汁推进率显著降低(P<0.05)，说明便秘模型成立。而与模型组相比，低浓度组无显著差异，益生菌复合配方(中、高浓度组)能显著提高墨汁推进率(P<0.05)，但高浓度组与空白组的墨汁推进率无显著差异，说明低浓度益生菌作用较弱，且复合菌液浓度越高，推进率越高。在高浓度益生菌的干预下，小肠墨汁推进率能接近正常水平，说明益生菌在便秘条件下能显著提高小鼠肠道推进率，并呈浓度依赖性。

表6 益生菌复合配方对小鼠小肠墨汁推进率的影响Table 6 Effects of the composite probiotics on intestinal ink propulsion rate in mice

2.1.2 对小鼠首粒黑便时间、粒数及重量的影响 由图1可知，与空白组相比，模型组首粒黑便时间、黑便粒数、黑便重量均有显著差异(P<0.05)，说明便秘模型建立成功。与模型组相比，干预组(中、高浓度的益生菌复合配方)能显著缩短首粒黑便形成时间，并显著增加6 h内黑便粒数及重量(P<0.05)；但低浓度益生菌组无明显作用效果；高浓度益生菌组可恢复至接近空白组水平，说明低浓度益生菌改善便秘的效果不显著，中、高浓度益生菌复合配方的摄入可显著促进小鼠肠道蠕动，进而促进小鼠排便效果，特别是在高浓度的益生菌干预下小鼠能恢复到正常水平。

图1 益生菌复合配方对小鼠6 h内首粒黑便时间、粒数及重量的影响Figure 1 Effects of composite probiotics on the first defecation time, grain number and weight of 6 h black stools in mice

有研究[18-19]表明，微生态失衡也是便秘发生的关键因素之一。其中成人便秘患者双歧杆菌属、乳酸杆菌属、拟杆菌属、链球菌属均显著降低[20]。微生物提高肠道动力的原因有：① 微生物主要通过发酵产生短链脂肪酸、甲烷等刺激肠道神经系统，加快肠道转运[21]；② 肠道菌群可影响5-羟色胺(神经内分泌因子和胃肠激素)的产生，促进肠动力[22]。陈家伦等[23]研究表明，益生菌组合物低、高剂量组可显著提高小肠推进率、黑便粒数和黑便重量，显著降低首粒黑便时间，具有改善慢传输型便秘的作用，与试验结果一致。

2.2 益生菌复合配方对小鼠肠炎的影响

2.2.1 大便情况疾病活动度(DAI)评价及肠黏膜损伤等级 由图2可知，模型组和干预组(低、中、高浓度组)DAI得分均高于空白组，说明各组均有不同程度的疾病症状。与空白组相比，模型组小鼠DAI评分显著增加(P<0.05)；与模型组相比，干预组(低、中、高浓度组)小鼠DAI评分随干预组中益生菌浓度的升高而降低。此外，经DSS干预的小鼠肠黏膜损伤评分等级均显著高于空白组小鼠(P<0.05)，说明DSS干预的小鼠出现了急性肠炎的症状，造模成功。与模型组相比，低浓度组干预后的小鼠肠黏膜损伤评分等级无显著差异，而中、高浓度组干预后的小鼠肠黏膜损伤评分均显著降低。说明中、高浓度的益生菌复合配方在急性肠炎症状下对肠黏膜有保护作用，且高浓度组的效果更佳，但仍未恢复至空白组水平。

图2 益生菌复合配方对小鼠大便情况疾病活动度(DAI)及结肠黏膜评分的影响Figure 2 Effects of composite probiotics on the disease activity index (DAI) and colonic mucosa grading in mice

2.2.2 结肠组织切片 由图3可知，与正常组小鼠结肠组织相比，模型组小鼠结肠组织出现明显的炎症，隐窝结构组织被破坏；与模型组相比，益生菌复合配方组大部分隐窝损伤被修复，组织结构逐渐恢复正常。益生菌复合配方能显著降低DAI及结肠黏膜损伤评分，可能是益生菌中含有一些专性厌氧菌，可以长期在肠道中定殖，具有维持小鼠肠道微生态平衡的功能[24]。同时益生菌中具有可以调节肠道屏障功能因子，可以分泌抗病源活性物质以抑制病原微生物的生长并有效阻止致病菌对小肠上皮细胞的损伤[25]。另外，益生菌中有一些可产丁酸的菌株，丁酸可有效地修复肠道黏膜上皮组织的再生，并具有一定的抗炎作用[26]。

图3 结肠组织切片Figure 3 Slices of the colon tissues

2.3 益生菌复合配方对小鼠腹泻的影响

2.3.1 对小鼠腹泻评分、结肠长度及重量的影响 由图4可知，根据腹泻评分，空白组无腹泻症状，其他各组均有不同程度的腹泻症状。与空白组相比，其他各组腹泻评分均有显著差异(P<0.05)，说明使用混合抗生素构建小鼠腹泻模型成功。模型组与空白组结肠长度无显著差异，说明腹泻对结肠长度无明显影响。在益生菌干预下结肠重量比正常小鼠更加发达，高浓度组与模型组的结肠重量具有显著差异(P<0.05)，说明高浓度益生菌对结肠重量有明显作用。

图4 益生菌复合配方对小鼠腹泻评分、结肠长度及重量的影响Figure 4 Effects of composite probiotics on the diarrhea score, colon length and colon weight

2.3.2 对结肠黏膜损伤的影响 由表7可知，与空白组相比，其他组肠黏膜损伤评分均具有显著差异(P<0.05)，说明腹泻模型造模成功。与模型组相比，干预组的肠黏膜损伤等级均显著降低，具有保护肠黏膜的作用(P<0.05)。由图5可知，与正常组小鼠结肠组织相比，模型组小鼠结肠组织出现明显的炎症，隐窝结构组织被破坏；与模型组相比，益生菌复合配方组大部分隐窝损伤被修复，组织结构逐渐恢复正常。

图5 益生菌复合配方对结肠形态学影响Figure 5 Effects of composite probiotics on the colon morphology

表7 益生菌复合配方在小鼠腹泻时对其结肠黏膜损伤的影响Table 7 Effects of composite probiotics on the colonic mucosal damage in the diarrhea model

抗生素造成腹泻的机制有：① 抗生素直接引起肠黏膜损害，造成肠上皮纤毛萎缩，降低胞内酶活性，导致胆汁合成障碍，减少脂肪吸收，最终造成腹泻；② 抗生素的使用导致敏感菌群被杀灭，从而造成肠道微生态失衡，致病菌增加，肠屏障受损，进而导致腹泻[27-28]。而益生菌复合配方具有抑制抗生素腹泻症状的功能，可能是在一定程度上抑制了病原微生物的生长，维护小肠肠道正常菌群的生长[29]。同时，益生菌在一定情况下可定殖到小鼠肠道中，并产生一系列活性机制，达到维护肠道生态环境的作用[30]。试验表明益生菌复合配方能显著降低结肠黏膜损伤评分，缓解抗生素所致腹泻。

3 结论

试验表明，在小鼠便秘症状下，益生菌可通过增加排便数量和重量、提高墨汁推进率等指标促进肠道蠕动，有效缓解便秘作用；在急性肠炎和腹泻症状下，益生菌能通过降低肠黏膜损伤评分，恢复隐窝结构组织，保护肠黏膜进而改善腹泻及炎症症状。但是益生菌复合配方改善肠道疾病的机制仍未明确，具体是单一菌改善还是复合菌协同作用仍未知，有待进一步研究。