8种中药水提液对尖孢镰刀菌的抑制效果

2022-09-15贾正燕王昌梅张啸赵兴玲吴凯尹芳杨斌梁承月张无敌

湖南农业大学学报(自然科学版) 2022年4期

贾正燕，王昌梅,2，张啸，赵兴玲,2，吴凯,2，尹芳,2，杨斌，梁承月，张无敌,2*

8种中药水提液对尖孢镰刀菌的抑制效果

贾正燕1，王昌梅1,2，张啸3，赵兴玲1,2，吴凯1,2，尹芳1,2，杨斌1，梁承月1，张无敌1,2*

(1.云南师范大学能源与环境科学学院，云南昆明 650500；2.吉林东晟生物质能工程研究院，吉林通化 134118；3.云南康艺三七种植有限公司，云南昆明 650032)

为减少三七根腐病的发生，尝试采用8种中药(姜黄、茵陈、金银花、马齿苋、黄芩、紫花地丁、黄连、黄柏)水提液对三七根腐病原菌中尖孢镰刀菌进行抑制，采用二倍稀释法测定8种中药对尖孢镰刀菌的最小抑菌浓度，采用生长速率法测定中药水提液对尖孢镰刀菌的抑菌活性。结果表明：8种中药水提液对尖孢镰刀菌均有抑制效果，其中，金银花水提液对尖孢镰刀菌的抑菌效果最佳，最大抑菌率可达75%，EC50最小，为5.55 mg/mL；黄连、金银花、黄芩对尖孢镰刀菌的MIC≤1 mg/mL，说明其对尖孢镰刀菌的有效起始抑菌浓度较低。

三七根腐病；中药水提液；尖孢镰刀菌；毒力；抑菌活性

三七()的土传病害主要是根腐病，严重时发病率可达到70%以上，造成三七植株连片死亡，甚至绝收[1]。三七根腐病的发病植株症状多样，主要表现为黄腐型、髓烂型、干裂型、湿腐型、急性青枯型、茎基干枯型等[2]。研究表明，三七根腐病的致病机制较为复杂，病原菌主要是真菌、假单胞菌和线虫[3]。恶疫霉()、尖孢镰刀菌()、腐皮镰孢菌()、草茎点霉()、立枯丝核菌()、毁灭柱孢()等是三七根腐病的致病菌[4–5]。尖孢镰刀菌寄主范围广，还可引起香蕉、棉花、玉米等100多种植物的枯萎病[6]。

目前，对三七根腐病的防治仍以土壤熏蒸或采用化学药剂灌根等方法为主，但化学药品残留对人类生活及环境造成危害。生物防治具有安全、高效、绿色等优点，越来越受各界学者关注。马玉楠[7]研究发现，黄花蒿叶甲醇提取物能有效降低尖孢镰刀菌的孢子活力，从而降低孢子萌发率，抑制其产孢量和菌丝生长。一定浓度的黄花蒿石油醚提取物可有效防控三七植株的发病率。金晶[8]研究发现，中药与厚朴酚联合具有较好抗真菌活性，对白色念珠菌的最低抑菌活性表现出协同作用。BAKKALI等[9]研究发现，植物精油可通过破坏真菌生物膜系统来降低真菌稳定性，导致细胞内环境紊乱，抑制病原真菌生长。崔蕾等[10]研究发现，黄柏等12种中药对玉竹根腐病病原菌表现出较强的抑制作用，抑菌率高于50%多菌灵800倍液。以上研究表明，植物提取物对根腐病具有一定的抑制效果，有替代化学防治来实现作物生产可持续发展的潜力。

在土壤中加入适宜的植物源药液，不仅能抑制植物病原菌对植物生长过程中的侵害，还可促进土壤中养分循环，改善土壤微生物结构，减少化肥农药的使用，保障三七的可持续种植以及病害防治的安全性[11]。吴晶[12]发现黄连、黄柏、金银花、紫花地丁、马齿苋、姜黄、黄芩对不同真菌有不同的抑制效果，黄柏水提液均能抑制多种致病性皮肤癣菌；黄连水提液对紫色毛癣菌、白念珠菌、絮状表皮癣菌等14种皮肤真菌有抑制作用；黄芩对白念珠菌和新生隐球菌均有较好的抑制效果。笔者以黄连、黄柏、茵陈、金银花、马齿苋、紫花地丁、黄芩、姜黄8种中药为原料，采用二倍稀释法和生长速率法研究了8种中药水提液对三七根腐病原菌尖孢镰刀菌的抑制效果，对8种中药水提液对尖孢镰刀菌的体外抑菌活性进行了探究，同时测定了其最低抑菌浓度(MIC)并进行毒力分析，以期为三七根腐病的防治以及生物农药的开发提供依据。

1　材料与方法

1.1　材料

尖孢镰刀菌()分离自云南文山三七根腐病病样，由云南省农村能源重点实验室提供。

黄连、黄柏、茵陈、金银花、马齿苋、黄芩、姜黄、紫花地丁等8种中药材均由市场购得。

1.2　方法

1.2.1中药水提液的制备

将各中药烘干，剪成0.5 cm左右的小段。各中药分别称取10 g，分别加入150 mL无菌水煮沸，小火熬煮30 min，待冷却后抽滤。将所得滤液用旋转蒸发仪在65 ℃下减压浓缩，制成浸膏，无菌蒸馏水定容至10 mL，制成1 g/mL的中药水提液，置于4 ℃冰箱，备用。

1.2.2中药水提液对尖孢镰刀菌的最小抑菌浓度(MIC)及毒力测定

取1 g/mL的中药水提液，采用生长速率法[13]测定8种中药水提液对尖孢镰刀菌菌丝生长的抑菌率。用二倍稀释法将1 g/mL的中药水提液分别配制成质量浓度分别为500.00、250.00、125.00、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95和0.98 mg/mL溶液，分别量取0.1 mL加入马铃薯琼脂糖培养基(PDA)表面，制作加药培养基。对照组在PDA培养基中加入0.1 mL无菌水。再用直径为9 mm的无菌打孔器从培养好的供试菌种均匀截取直径为9 mm的菌块，空白组直接放菌块，培养4 d。采用十字交叉法[14]测量培养1、2、3、4 d时各处理组尖孢镰刀菌的菌落直径，最小抑菌浓度计算所得抑菌率[15]即为最小抑菌率。统计分析得到不同中药水提液对尖孢镰刀菌的毒力方程、抑制中浓度EC50。

1.3　数据分析

试验数据采用Origin 2017、Excel 2010和SPSS 24.0进行处理并分析。

2　结果与分析

尖孢镰刀菌在PDA培养基上培养7 d，菌落呈圆形(图1–1)，平均直径为80 mm；菌落突起、呈絮状，白色、浅粉色或肉色，略带紫色；菌丝呈柔毛状，菌丝丰富，表面光滑(图1–2)；孢子多为镰刀形或椭圆形(图1–3)。将尖孢镰刀菌与中药共同培养4 d后，尖孢镰刀菌的菌丝出现缢缩分支，且菌丝体断裂(图1–4)。

1　菌落形态；2　菌丝体形态；3　孢子；4　药物作用后的菌丝体。

2.1　中药水提液对尖孢镰刀菌的抑制作用

由图2可以看出，随着中药水提液质量浓度的降低，尖孢镰刀菌菌圈直径越大，说明中药水提液对尖孢镰刀菌的菌丝生长抑制效果逐渐减弱。500 mg/mL(图2–1、图2–4、图2–7)时，各中药水提液对尖孢镰刀菌的菌圈生长具有较明显的抑制作用，随着浓度降低，各中药水提液对尖孢镰刀菌的抑制效果减弱。与对照相比，金银花水提液(图2–3)处理可有效抑制尖孢镰刀菌菌圈生长，黄连水提液(图2–6)在低浓度时对尖孢镰刀菌抑制效果减弱，而紫花地丁水提液(图2–8、图2–9)在低浓度时对尖孢镰刀菌的生长呈现微弱的促进作用。

1　500 mg/mL金银花作用；2　15.63 mg/mL金银花作用；3　0.98 mg/mL金银花作用；4　500 mg/mL黄连作用；5　15.63 mg/mL黄连作用；6　0.98 mg/mL黄连作用；7　500 mg/mL紫花地丁作用；8　15.63 mg/mL紫花地丁作用；9　0.98 mg/mL紫花地丁作用。

如表1所示，随着中药水提液质量浓度降低，对尖孢镰刀菌的抑制效果均显著下降。其中，马齿苋、金银花对尖孢镰刀菌的抑制效果最佳，培养4 d时，对尖孢镰刀菌的最大抑菌率均为76.44%；黄连质量浓度为500、250、125 mg/mL时，对尖孢镰刀菌有较好的抑制效果，抑菌率分别达71.73%、71.20%、68.06%；姜黄、茵陈、黄芩、黄连、马齿苋水提液处理尖孢镰刀菌的菌丝生长均随培养时间增加，抑菌率显著增大，抑菌效果显著增强，4 d时最大抑菌率分别为67.28%、56.28%、57.59%、71.73%、76.44%。黄柏在2 d时抑菌率达最大，最大抑菌率为59.03%；紫花地丁在3 d时抑菌率达最大，最大抑菌率为18.69%。此外，各中药对尖孢镰刀菌的抑制效果呈现高浓度抑制，低浓度促进生长的趋势。

表1　8种中药水提液对尖孢镰刀菌的抑菌率

中药时间/d抑菌率/% 7.81 mg/mL3.91 mg/mL1.95 mg/mL0.98 mg/mLCK 黄连1(29.69±1.55)Ba(8.59±1.55)Cd(4.69±1.55)De(3.91±0.58)Be(1.07±1.33)Bf 2(32.60±0.76)Ac(15.74±2.16)Bd(10.64±0.49)Ce(6.38±1.73)Af(2.73±0.05)Ag 3(30.67±3.12)ABde(35.50±3.12)Acd(34.02±5.12)Bcd—(3.12±1.05)Af 4(28.01±2.12)BCd(34.55±2.92)Acd(39.09±0.94)Ac(0.45±0.76)Ce(2.26±1.58)Ae 黄芩1(29.69±2.53)Aa(6.25±2.07)Bc(6.25±2.31)Bc(4.69±1.62)Ad(1.07±1.33)Be 2(17.62±1.55)Dfg(19.19±2.34)Af(5.53±0.52)Bh(4.26±0.44)Ai(2.73±0.05)Ag 3(22.36±1.64)Ce(18.05±1.87)Af(0.30±0.54)Ch(0.89±0.75)Ch(3.12±1.05)Ag 4(24.87±1.06)Be(19.32±1.63)Af(9.55±1.68)Ad(1.82±1.01)BCh(2.26±1.58)Ah 茵陈1(2.34±0.00)Dd(0.75±1.21)Ce(2.26±0.18)Cd—(1.07±1.33)Be 2(11.01±0.88)Be(10.87±1.66)Ae(10.00±0.00)Ae(25.22±0.49)Ad(2.73±0.05)Ah 3(7.35±0.73)Cef(1.64±0.71)Bh(8.85±1.58)Be(13.11±0.55)Bd(3.12±1.05)Ag 4(13.61±0.58)Ae(2.29±0.73)Bf(1.43±2.23)fCg—(2.26±1.58)Af

表1(续)

同行不同小写字母示同种中药不同浓度处理间的差异有统计学意义(<0.05)；同一中药同列不同大写字母示不同培养时间的差异有统计学意义(<0.05)。

2.2　8种中药水提液对尖孢镰刀菌的最小抑菌浓度(MIC)及毒力效果

由表2可以看出，金银花的EC50最小，为5.55 mg/mL，对尖孢镰刀菌的毒力效果最强；其后依次为马齿苋、姜黄、黄连，EC50均较小，毒力效果相当；黄柏和紫花地丁的EC50过大，对尖孢镰刀菌基本没有毒力作用；黄连、金银花、黄芩对尖孢镰刀菌的MIC≤1 mg/mL，说明其对尖孢镰刀菌的有效抑菌浓度较低，可有效抑制尖孢镰刀菌的生长。

表2　8种中药水提液对尖孢镰刀菌的最小抑菌浓度及毒力效果

3　结论与讨论

本研究中，马齿苋、姜黄、茵陈对尖孢镰刀菌的抑制效果相对较明显，尖孢镰刀菌培养4 d时，最大抑菌率分别为76%、67%、56%，最小抑菌浓度均为2 mg/mL；黄柏在2 d时对尖孢镰刀菌的抑菌效果达到最优，随着培养时间的增加，抑菌效果逐渐下降，4 d时最小抑菌浓度为4 mg/mL。对8种中药水提液的抑制效果进行毒力回归分析，发现黄柏和紫花地丁EC50过大，实际应用过程中难以达到抑制中浓度，说明这2种中药水提液对尖孢镰刀菌基本没有毒力作用。李纪潮等[11]研究不同中药不同部位提取物对三七根腐病病原菌的抑菌效应，发现各提取物对尖孢镰刀菌和腐皮镰孢菌的抑菌率为5%～60%，苦蒿和大蓟提取物对尖孢镰刀菌抑菌效果显著，抑菌率均大于55%；其结果中各中药对病原菌的抑菌效果都较本研究结果弱，可能是同一中药提取物对不同致病菌抑制效果有所差异，而相同致病菌对不同中药提取物敏感性也不同；此外，其研究还发现各提取物对三七种子萌发表现出“低促高抑”的浓度效应，本研究结果与其相似。与对照相比，本研究中各中药处理抑制了尖孢镰刀菌的菌丝生长，并对菌丝形态进行观察，证实各中药对尖孢镰刀菌菌丝生长有良好的抑制效果。

天然中草药不仅无污染、抑菌范围广、不易产生耐药性、价格低廉[16]，还能营养复壮、提高作物免疫力、修复伤口[17]，目前已成为微生物病害防治的重点关注对象。本研究采用水提法提取中药中的有效成分，探究各中药不同浓度水提液对三七根腐病原菌中尖孢镰刀菌的抑制效果，并通过对菌丝形态的观察，证实各中药水提液可使尖孢镰刀菌的菌丝缢缩分支，导致菌丝体断裂，从而抑制尖孢镰刀菌的生长，这与已报道的研究结果[18–19]相似。而于未博[20]研究了丁香提取物中主要成分丁香酚对三七根腐病真菌的抑制作用，发现丁香酚通过破坏细胞完整性，从而起到抑菌效果。冯升来等[21]研究发现，茵陈精油对枯草芽孢杆菌、白色恋珠菌的生长均有非常好的抑制效果，能破坏菌体细胞壁，使菌体细胞壁产生孔洞，导致细胞内容物渗出，影响菌体基因表达、能量代谢等，从而导致菌体细胞衰竭；这可能是不同药物作用机制及靶点不同，导致作用细胞不同部位抑制其生长。但各中药提取液抑制尖孢镰刀菌菌丝生长的分子机制还有待进一步研究。

本研究结果表明，8种中药水提液对尖孢镰刀菌菌丝生长均有抑制效果，随着浓度的减小，水提液对尖孢镰刀菌的抑制效果逐渐减弱，黄连、金银花、黄芩对尖孢镰刀菌的MIC≤1 mg/mL；金银花的EC50最小，最大抑菌率为76.44%，抑菌效果最好。

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Antifungal effects of water extracts from 8 kinds of Chinese medicines on

JIA Zhengyan1，WANG Changmei1,2，ZHANG Xiao3，ZHAO Xingling1,2，WU Kai1,2，YIN Fang1,2，YANG Bin1，LIANG Chengyue1，ZHANG Wudi1,2*

(1.School of Energy and Environmental Science, Yunnan Normal University, Kunming, Yunnan 650500, China; 2.Jilin Dongsheng Biomass Energy Engineering Research Institute, Tonghua, Jilin 134118, China; 3.Yunnan Kangyi Sanqi Planting Co. Ltd, Kunming, Yunnan 650032, China)

In order to reduce the occurrence of root rot of), the water extracts of 8 traditional Chinese medicines(,,,,,,,) were used to inhibit)，one of the pathogens of rootrot of. The minimum inhibitory concentration(MIC) of 8 traditional Chinese medicines againstwas determined by double dilution method, and the antifungal activity of water extracts of Chinese medicines againstwas determined by growth rate method. The results showed that the water extracts of 8 kinds of traditional Chinese medicines had inhibitory effects on. Among them, the water extract ofhas the best fungicidal effect on, the maximum fungicidal rate was 75% and the EC50was the lowest being 5.55 mg/mL.,andall showed MIC≤1 mg/mL against, indicating their effective initial antifungal concentration againstwas low.

root rot of; water extract of Chinese medicine;; virulence; antifungal activity

S435.67

1007-1032(2022)04-0454-06

贾正燕，王昌梅，张啸，赵兴玲，吴凯，尹芳，杨斌，梁承月，张无敌．8种中药水提液对尖孢镰刀菌的抑制效果[J]．湖南农业大学学报(自然科学版)，2022，48(4)：454–459．

JIA Z Y，WANG C M，ZHANG X，ZHAO X L，WU K，YIN F，YANG B，LIANG C Y，ZHANG W D．Antifungal effects of water extracts from 8 kinds of Chinese medicines on[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2022，48(4)：454–459．

http://xb.hunau.edu.cn