天然类胡萝卜素的生物合成研究进展

周琳 梁轩铭 赵磊

（1.中国科学院天津工业生物技术研究所，天津300308；2.中国科学院系统微生物工程重点实验室，天津300308）

类胡萝卜素因具有抗氧化和抗肿瘤等特性，已被广泛应用于医药保健、食品和化妆品生产等行业［1］，其主要来源为微藻和高等植物及微生物和部分动物等。由于每种藻类或植物富含的类胡萝卜素种类存在很大差异，故需要从不同藻类或植物中使用不同的提取方法来分离得到各种类胡萝卜素。微藻中分离提取的虾青素和β-胡萝卜素均已实现商业化生产。近年来，人类对类胡萝卜素的需求量显著增加。据统计，2016-2021年，类胡萝卜素的市场值年复合增长率为3.5%；到2021年时，其全球生产总值可达 15.2亿美元［2］（图1）。

图1 2021年主要类胡萝卜素所占市场份额预测Fig.1 Market share forecast of major carotenoids in 2021

经济的发展使人类生活水平不断提高，人们更加注重营养保健，对类胡萝卜素需求量增加。同时，相对于化学合成的类胡萝卜素，天然合成类胡萝卜素更受人青睐。但是，由于藻类和植物中类胡萝卜素的含量较低，即使提取技术的不断发展也无法满足人类对天然类胡萝卜素日益增长的需求。合成生物学技术的不断的发展，极大的推动了类胡萝卜素和脱辅基类胡萝卜素等产品在微生物底盘细胞中的合成［3］。类胡萝卜素的强疏水性化学性质使其很容易镶嵌在磷脂双分子层生物膜上，这给底盘细胞造成很大压力，在一定程度上也限制了可合成类胡萝卜素的底盘细胞选择空间［4］。随着对类胡萝卜素合成途径的进一步解析，合成途径中催化反应的大部分酶和调控基因已经被鉴定，一方面为合成类胡萝卜素细胞工厂的构建提供理论背景；另一方面也为其在工业、医学、美妆和食品等领域的广泛应用提供了科学依据。

1 类胡萝卜素的来源和生物学功能

类胡萝卜素种类繁多，分布广泛，在高等植物叶片和花瓣、微生物、藻类中都已发现类胡萝卜素［5］。大多数的类胡萝卜素分子骨架中都具有C40共轭双键多烯链和末端碳环，每种类胡萝卜素的特性由其环状烃和含氧官能团的种类决定［6］。按照化学结构特性和所含官能团的差异，又可以将类胡萝卜素分成胡萝卜素类和叶黄素类。类胡萝卜素不仅能调节植物的生长与发育，还与人类营养和保健有密切关系［7］。类胡萝卜素还是天然的抗氧化剂，具有预防和减缓疾病的功能［8］，也是维生素A（视黄醇）的生物合成前体。

1.1 类胡萝卜素的来源

天然类胡萝卜素主要是从藻类、植物以及微生物发酵中获得。在藻类中，雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）和杜氏盐藻（Dunaliella salina）可分别合成虾青素和β-胡萝卜素。雨生红球藻（Haematococcus pluvialis）合成虾青素的能力最强，其虾青素约占胞内类胡萝卜素总量的90%，重量可达细胞干重的7%左右［9］。细菌和真菌等也能合成类胡萝卜素，如欧文氏菌（Erwinia）和红法夫酵母（Red Fife yeast）等［10］。高等植物的根、茎、叶和花瓣也能合成各种类胡萝卜素。由于藻类、微生物和植物体系具有天然的类胡萝卜素合成途径，所以它们是类胡萝卜素合成细胞工厂的理想选择。

虾青素在分类上属于酮式类胡萝卜素，在藻类、真菌和细菌中广泛存在。其具有3种旋光异构体，分别是左旋虾青素、右旋虾青素和全反式消旋虾青素，不同异构体在抗氧化作用方面存在差异［11］。β-胡萝卜素广泛存在于自然界中，其末端具有2个β-紫罗酮环结构［12］；其主要以4种异构体形式存在，天然合成和化学合成β-胡萝卜素的主要差异就体现在全反式和顺式异构体所占比例的不同［13］。叶黄素主要存在于绿色植物的叶片和花朵中［14］。其化学分子式结构包括2个酮环和3个手性中心，自然界中共存在8 种异构体。它主要参与捕获光能、调节植物的生长和发育等［15］。大多数的藻类都含有叶黄素，如小球藻、栅藻和衣藻等。其中，以小球藻含量较高，是生产叶黄素的优势藻株［16］。

1.2 类胡萝卜素的生物学功能

类胡萝卜素由于具有强抗氧化性，其在抗氧化方面有非常重要的作用（表1）。研究发现，添加250 mg/kg 体重的叶黄素不仅能有效减少辐射诱导给白化小鼠造成的氧化损伤，还有利于维持其抗氧化系统的稳定性［17］。此外，不同类胡萝卜素的抗氧化强弱方面有很大差异，不同种类的类胡萝卜素以一定浓度配比组合后，其在抗氧化方面还具有协同作用。例如，虾青素和β-胡萝卜素浓度比为1∶1时，其协同抗氧化作用最强［18］；玉米黄质和叶黄素质量比为2∶1时，其协同抗化学作用最强［19］。

表1 主要类胡萝卜素的生物学功能Table 1 Biological functions of main carotenoids

叶黄素和玉米黄质是人类角膜中黄斑色素的重要成分，其能够保护视网膜免受蓝光损伤，提高视觉灵敏度［20］。因此，叶黄素常被用于眼部保健，可以预防和减缓白内障、老年性黄斑变性和视网膜神经疾病等眼部退行性疾病［21］。当人体叶黄素和玉米黄质摄入量不足时，会增加黄斑病变风险［22］。类胡萝卜素中以虾青素和角黄素抗癌效果较好。研究表明，虾青素能够显著降低癌症发病率，阻止癌细胞恶性增殖和转移，并能减少肿瘤的重量和大小［23］。角黄素的抗癌活性更高，研究表明角黄素诱导的细胞凋亡与ROS有关，ROS引起的细胞毒性会造成半胱天冬酶-3和-9的催化裂解［24］。对前列腺癌的研究发现，岩藻黄素及其代谢物岩藻青醇可抑制细胞生长，并诱导前列腺癌PC-3细胞凋亡和激活半胱天冬酶-3［25］。岩藻黄质和岩藻黄醇也可通过调节各种分子的表达和信号转导途径，诱导肿瘤细胞周期阻滞［26］。

2 类胡萝卜素的生物合成

人们对植物体中类胡萝卜素的合成途径研究最早。近年来，科学家对于微生物和藻类中的合成途径进行深入解析后发现，不同生物的合成途径存在差异，获得的类胡萝卜素种类和产量也不尽相同［28］。类胡萝卜素合成途径所需的酶在植物和微生物中有所不同，在植物中的分工更细。例如，催化八氢番茄红素合成和番茄红素环化的酶，在植物中由两个酶分别负责，而在酵母和霉菌中仅由一个酶完成［29-30］。虽然微藻在分类学上被列为低等植物，但其兼具高等植物和微生物的特性，能合成的类胡萝卜素种类较多。其既可合成高等植物中所特有的α-胡萝卜素和叶黄素，又能合成微生物中普遍存在的角黄素和虾青素，故微藻在用作类胡萝卜素合成底盘细胞改造方面具有独特的优势［31］。类胡萝卜素合成途径的解析，为其合成细胞工厂的构建提供了理论依据，其合成始于前体物质牻牛儿基牻牛儿基焦 磷 酸（geranylgeranyl pyrophosphat，GGPP）。 下面将以高等植物为例，简述类胡萝卜素的合成过程（图2）。

图2 类胡萝卜素合成途径Fig.2 Carotenoid synthesis pathway

2.1 GGPP的生物合成途径

GGPP的生物合成是类胡萝卜素合成过程中的重要步骤，其合成过程可以简单分成两大步，即前体物质异戊二烯焦磷酸（isopenteny diphosphate，IPP）和二甲基丙烯焦磷酸（dimethylallyl diphosphate，DMAPP）的合成；由前体物质IPP和DMAPP合成GGPP。根据所发生场所的不同，IPP的合成途径又分为甲羟戊酸（mevalonic acid，MVA）途径［32］和甲基赤藓糖醇（methyl erythritol phosphate，MEP）途径［33］，合成过程都是被区室化的。其中，MVA途径主要存在于大多数的哺乳动物和酵母细胞质基质和内质网上，起始物质是乙酰辅酶A；MEP 途径一般存在于高等植物、部分细菌和藻类细胞原生质体中［34］，起始物质是3-磷酸甘油醛（GA-3-P）和丙酮酸［35］。在生成IPP和DMAPP后，MVA和MEP的催化步骤基本相同。

2.2 从GGPP到胡萝卜素类合成

从GGPP起始，参与合成各种胡萝卜素的酶包括氧化还原酶类（EC1）的PDS（phytoene desaturase）和 ZDS（ζ-carotene desaturase）、转移酶类（EC2）的PSY（phytoene synthase）及异构酶类（EC5）的LCYe（lycopene ε-cyclase） 和 LCYb（lycopene β-cyclase）等。

主要过程为：首先，GGPP在PSY催化作下，合成八氢番茄红素，其他各种类胡萝卜素都是在此基础上经进一步的脱氢和环化生成。PSY是该途径的关键限速酶，其在细菌和真核生物中的编码基因分别是CrtB和PSY，改变它的表达量或活性可以调节代谢途径通量［36］。例如，在油菜籽和马铃薯衍生愈伤组织中，过表达组成型PSY可增加细胞中总类胡萝卜素含量，β-胡萝卜素的合成也显著增加［37］。

2.3 从胡萝卜素类到叶黄素类的合成

从胡萝卜素类合成叶黄素类色素的代谢途径需要5种氧化还原酶类参与，包括LUT1（carotenoid ε-hydroxylase）、CrtZ（β-carotene 3-hydroxylase）、LUT5（β-ring hydroxylase）、ZEP（zeaxanthin epoxidase）和 VDE（violaxanthin deepoxidase）。β-胡萝卜素在经过连续的羟基化反应后，先生成β-隐黄质，后转化为玉米黄质。其中，由玉米黄质脱环化生成花药黄质，再进一步反应生成堇菜黄质的过程是可逆的；催化正向两步反应（即环化反应）的酶都是ZEP，反应在弱光或黑暗条件下进行。在拟南芥中，该酶的编码基因是AtABA1；催化逆向两步反应（即脱环化反应）的酶均是ZEP，反应在强光条件下进行；在拟南芥中该酶的编码基因为AtNPQ1，整个循环过程被称作叶黄素循环（Lutein cycle）［41］。目前，参与各个反应步骤的催化酶都已得到解析，尤其是在高等植物拟南芥中（表2）。胡萝卜素类到叶黄素类的合成途径研究，可用于定向进化或逆境胁迫等方法合成特定种类的类胡萝卜素。由于PSY 在多数植物中为单拷贝基因，故其是用基因工程技术改良植物类胡萝卜素含量的理想靶标［38］。其次，八氢番茄红素在PDS催化作用下生成ζ-胡萝卜素，ζ-胡萝卜素在ZDS的催化作用下生成番茄红素。Gao等［39］的研究表明白光照可以抑制葡萄柚（Citrus paradisi）愈伤组织中CpPDS 和CpZDS 的表达，从而减少其番茄红素的合成。Qin等［40］研究发现，拟南芥中类胡萝卜素合成途径的AtPDS3 基因发生突变后，AtPSY 和AtZDS 等基因的表达水平会显著降低，其类胡萝卜素合成受阻，叶绿素和赤霉素的合成途径也受到抑制。

表2 参与类胡萝卜素生物合成的酶及编码基因Table 2 Enzymes and encoding genes involved in carotenoid biosynthesis

番茄红素在不同的酶催化下可以生成不同的胡萝卜素：在CrtE的催化作用下可环化生成δ-胡萝卜素，再进一步生成ε-胡萝卜素；在CrtY催化作用下可生成γ-胡萝卜素，并进一步生成β-胡萝卜素。同时，CrtB 还可催化δ-胡萝卜素生成α-胡萝卜素。由GGPP 起始合成的胡萝卜素种类非常丰富，是天然类胡萝卜素合成途径的重要组成部分，对于该途径的深入解析将为类胡萝卜素生物合成途径的设计、改造和应用提供理论依据。

3 类胡萝卜素合成细胞工厂的构建及合成生物学策略

类胡萝卜素的生物合成路径可以分为上游路径和下游路径，以最基本的IPP/DMAPP 为节点。上游路径是IPP和DMAPP的合成，有MEP和MVA两种途径；下游路径则是以IPP和DMAPP 为起点，通过多步反应和修饰，最终合成多种类胡萝卜素及其衍生物。

构建类胡萝卜素合成细胞工厂是一个复杂的过程，涉及到多模块的组装和适配等诸多问题。这不仅需要根据目标产品选择合适的催化元件；有时，为了解除代谢中间体的反馈抑制效应，还需要增强NADPH和ATP的合成以及增加GGPP前体供给或引入异源MVA路径等［42］。类胡萝卜素合成途径所需的催化元件，包括催化途径化学反应的各种酶，如合成酶、脱氢酶、环化酶、羟化酶和酮化酶等。为了提高类胡萝卜素的产量，需要在底盘细胞中最大限度地增加从底物到目标产物的代谢通量，同时尽量减少非必需副产物或代谢中间体的产生。因此，需选择最优底盘细胞和催化元件，并从催化特性、表达水平、底盘适应性等多个维度进行组合适配。

3.1 类胡萝卜素合成底盘细胞的选择和改造

合成生物学技术的不断发展，极大的推动了大肠杆菌（Escherichia coli）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae） 和 耶氏 解 脂 酵母（Yarrowia lipolytica）等底盘细胞高效合成类胡萝卜素及其衍生物（表3）［43］。大多数类胡萝卜素都具有强疏水性，故大量的类胡萝卜素在细胞内合成后，会损伤细胞膜结构并危害细胞的正常生理功能［44］。此外，微生物底盘细胞中有限的膜结构，也在一定程度上限制了类胡萝卜素产量提升空间；而且，类胡萝卜素的强还原性还会触发底盘细胞胁迫响应，使胞内反应活性氧（reactive oxygen species，ROS）的水平显著提高而反馈抑制细胞生长［45］。因此，采用诱导型启动子使生产菌株的生长与生产解偶联［46］、创建工程化转运蛋白和膜囊泡转运系统，可促进类胡萝卜素外排、弱化膜系统压力［47］等，降低类胡萝卜素合成的反馈抑制效应。

表3 合成类胡萝卜素细胞工厂的构建示例Table 3 Construction examples of a synthetic carotenoid cell factory

底盘细胞复杂的内环境系统，决定了目标产物的合成必然会受到胞内其他各方面因素的影响。尤其是，其内源非必需基因对类胡萝卜素合成能力有重要的影响［48］。对底盘细胞非必需基因的调控、设计和改造，有助于增加外源表达模块与其内环境的适配，增强细胞耐受力，强化目标路径代谢流量。但考虑到可理性设计的非必需基因数目及其对内环境影响有限，因此，需借助随机诱变等非理性设计策略以增加基因和相应表型的多样性，进而加速菌株的实验室进化过程［49］。

植物底盘因在蛋白表达、翻译后修饰以及催化环境上更加贴近产物的天然宿主，近年来，已得到更多研究人员的青睐。目前，科研人员可使用烟草、番茄和水稻等作为底盘细胞生产番茄红素等类胡萝卜素产品［50］。例如，刘耀光院士团队将类胡萝卜素合成路径导入到水稻胚乳中，获得了富含各种类胡萝卜素的大米新品种［51］。此外，莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）和集胞藻（synechocystis）等因具有天然类胡萝卜素合成路径，也是理想的植物底盘细胞［52］。

3.2 类胡萝卜素合成途径的模块组装与适配

类胡萝卜素细胞工厂的构建涉及多模块组装，以及路径模块间催化性能、表达水平等多因素的组合适配等（图3）。最终目标为最大限度地增加从底物到目标产物的代谢通量，减少非必需副产品和代谢中间体的积累［53］。类胡萝卜素合成步骤中公认的限速酶包括CrtE、CrtI、CrtZ和CrtW，这些酶具有相对宽泛的底物选择性，可以连续催化多步反应。但是，不同来源的限速酶在催化连续多步反应时，其反应步数可能不同，这极大的影响目标化合物在总类胡萝卜素含量中的占比［54］。另外，催化元件的底物选择差异，也会影响代谢中间体的转化速率［55］。因此，筛选、组合不同来源的催化元件是提高类胡萝卜素合成通量、降低代谢中间体积累的有效手段［56］。

图3 类胡萝卜素合成途径的模块组装与适配Fig.3 Modular assembly and adaptation of carotenoid synthesis pathways

同时，通过调节模块表达水平，也可达到提高整体代谢流量、弱化限速步骤的目的［57］。在调整模块表达强度时，可改变启动子强度、拷贝数、模块在染色体上的整合位置等。通常，可将模块分别克隆到不同质粒进行表达，这有利于快速建立强度多样化的表达文库，调整不同模块的表达水平。同时，通过配合使用不同强度的启动子、调整质粒的复制起始位点等手段可增加文库的多样性、拓宽模块表达强度的动态范围［58］。为实现类胡萝卜素合成途径基因模块的稳定表达，可采用底盘基因组整合方式。表达模块在染色体上的插入位置和拷贝数，对模块的整体表达水平和类胡萝卜素合成路径通量有较大影响。

在类胡萝卜素细胞工厂的构建中，要获得模块间的最佳适配效果，需对所用催化元件的催化性能、基因拷贝数、表达水平以及元件在染色体上的整合位置、排列顺序等诸多因素进行筛选，这就需要构建足够大的文库以满足所需覆盖度。模块化代谢工程（modular metabolic engineering，MME）可将代谢途径中所涉及的催化单元进行聚类分组，将每组催化单元的表达盒子视为一个模块［59］。该方法只涉及平衡模块间的表达水平，这将极有利于降低类胡萝卜素细胞工厂构建的复杂性。

4 总结和展望

类胡萝卜素由于其具有鲜艳的色彩和重要的生物学功能，被广泛用于医药、食品和保健行业，其商业价值较高。近年来，人们对类胡萝卜素的需求在不断加大。目前，类胡萝卜素的化学全合成技术成熟，是生产的主要来源，但其食用安全性具有不确定性。因此，通过构建类胡萝卜素合成细胞工厂生产相关产品，已得到更多关注。为使类胡萝卜素合成细胞工厂获得最大的生产能力，需要对其进行合理的改造和调控。为有效解决细胞代谢流失衡、中间体积累等问题，需要构建调控元件、设计基因线路以精确调节物质流及能量流，这也需要借助于高通量筛选、酶设计及计算机模拟、模型分析、耦合基因控制元件等。

合成生物学技术的不断发展，为合成类胡萝卜素细胞工厂构建带来了新的契机。这不仅使类胡萝卜素合成相关元件在工程学上模块化，而且具有非常充分的生物学特征，为整合相关特征元件用于构建具有特定生物学功能的生物系统，并实现大规模的设计、开发、改造与应用等提供了更多可能。由此获得的类胡萝卜素合成代谢途径，不仅具有更好的可预测性，而且简化了改造过程，提高了传统代谢工程效率。此外，计算机辅助设计、深度学习等可加速实现并优化代谢途径设计、流程构建等。借助于连续的设计、构建、测试与学习模型，可望达到预先评价目标过程的效果，这将有助于构建出更高效、更稳定的人工合成细胞工厂。多学科的交叉融合，必定会促使类胡萝卜素合成细胞工厂构建向着高通量、智能化、高效率的方向发展。