添加不同种类的氨基酸对紫色红曲霉菌合成液态发酵红色素的影响

陈玲娟 许世锦 胡文林 谢凤娇

广东天益生物科技有限公司 广东湛江 524300

红曲色素是药食两用微生物红曲霉菌(Monascus spp)的次生代谢产物,产生的天然色素是经人类世代食用证明的安全色素。红曲色素具有良好的着色性、热稳定性、光稳定性、金属离子稳定性和氧化还原剂稳定性。作为食品添加剂，红曲色素被广泛应用于肉制品、调味品、酒类、腌制蔬菜以及面制品中。红曲色素是一种属于聚酮类色素的混合色素[1]，红曲色素中已经探明结构的有10种，其中6种为醇溶性色素，4种为水溶性色素。醇溶性色素有红斑素、红曲红素、红曲素、红曲黄素、红斑胺和红曲红胺等[2]。

钱俊青[3](2010)等研究得出提高红曲色素水溶性的方法，用4mg/mL海藻酸钠溶液和红曲色素乙醇提取液以1∶3体积混合，60℃水浴回流40min可以提高红曲色素的水溶性且对酸的稳定性。有研究报道溶多糖单加氧酶AoAA13能够促进淀粉水解作用提高淀粉的降解速率，能够促进红曲霉红曲色素的产量[4]。从米曲霉中克隆得到AoAA13基因，通过农杆菌介导转化到红曲霉CICC41233，获得工程菌株红曲霉AA13-4。发酵6d，红曲霉AA13-4的红曲色素总色价相比红曲霉CICC41233提高了12.9%。张晓伟[5](2013)等研究人员通过研究温度、pH对红曲色素的溶解度和稳定性的影响，得出温度升高和pH增大会使色素的溶解性增大。在30～60℃色素较稳定，70～100℃色素的稳定性减小；pH值5～9红曲色素水溶液稳定，强酸、强碱环境都会对红曲色素造成不稳定。

已有相关研究报告说明氨基酸对于红曲红色素的合成代谢是一个非常重要的影响因子[6]。田园[7](2014)等研究表明通过添加4g/L的酪氨酸不仅有利于红曲霉突变菌株合成代谢黄色素，还能降低橘霉素的代谢生成量，其余所选氨基酸都不利于黄色素的合成代谢。张斌[8](2016)等研究表明不同的氨基酸种类和含量能显著影响红曲色素的组成和产量。当组氨酸添加量为7g/L时，对红色素合成的增强作用最显著，其峰值产量提高了32.7%，但红色素总色价才达到86.5u/mL；当酪氨酸添加量为7g/L时，对黄色素合成的增强作用最显著，其峰值产量提高了24.8%。而异亮氨酸、蛋氨酸的添加使红色素和黄色素的合成均受到显著抑制，其余氨基酸对色素合成则表现出不同程度的抑制或者无显著影响。因此，筛选出对红色素的合成具有显著促进作用的氨基酸种类及其添加量，有利于提高红曲色素的产量和单色色素的分离纯化与产品制备，从而提升产品附加值以及开发应用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

紫色红曲霉菌(M.purpureus)，实验室保存菌株；

可见分光光度计，722s型，上海仪电分析仪器有限公司；

单层摇瓶机，SPH-300D，上海世平实验设备有限公司；

电子天平，JJ224BC，常熟双杰测试仪器厂；

生化培养箱，LRH-150，上海一恒科学仪器有限公司；

洁净工作台，SJ-CJ-LFD，苏州苏洁净化设备有限公司；

氨基酸，天津市大茂化学试剂厂。

1.2 培养基与培养条件

1.2.1 斜面培养基

葡萄糖3%，酵母膏5%，琼脂1.5%，KH2PO40.1%，NaNO30.3%，MgSO4·7H2O 0.05%，FeSO4·7H2O 0.01%，蒸馏水1 000mL，pH自然。

1.2.2 摇床种子培养基

葡萄糖5%，蛋白胨2%，玉米浆0.5%，NaNO30.2%，KH2PO40.1%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH值

3.5～5.0。

1.2.3 发酵液培养基

大米粉5.0%，葡萄糖2.0%，黄豆1.0%，玉米浆0.5%，NaNO30.1%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，pH值3.5～5.0。

1.2.4 发酵液培养基(添加氨基酸)

大米粉5.0%，葡萄糖2.0%，黄豆1.0%，玉米浆0.5%，NaNO30.1%，KH2PO40.2%，MgSO4·7H2O 0.1%，氨基酸0.2%，pH值3.5～5.0。

1.3 培养方法

斜面培养方法：使用无菌接种针挑选单菌落并移接至新鲜的PDA斜面培养基上继续培养。挑选其中菌落较大，颜色较深的单菌落，接种到斜面培养基，每个菌落接三支斜面，在30℃培养箱中培养至菌丝长满斜面，培养时间约7d。

种子液培养方法：用无菌水轻轻洗脱落斜面培养上的孢子，倒入装有少许玻璃珠的500mL三角瓶中，摇匀静置。用无菌的吸管吸取孢子悬浮液到种子培养基上，在摇床上放置培养，温度30±2℃，转速180r/min，培养时间36～48h。

发酵培养方法：用无菌吸管按接种量8%～10%，将种子液接种于发酵培养基中培养，温度30±2℃，转速180r/min，培养时间7～8d。

1.3.1 红曲色素的检测

按照GB1886.181-2016《食品安全国家标准食品添加剂红曲红》标准要求检验。发酵液色价检验方法:用10mL刻度吸管准确吸取发酵液1mL缓慢放入试管中,再加入9mL(70%)乙醇,摇匀,使之彻底溶解20min,用快速滤纸过滤,按色价的高低变化稀释倍数,用722s型可见分光光度计在波长495～505nm测定吸光值[9]。色价计算见公式(1)。

色价(U/mL)=稀释倍数×吸光值

(1)

2 结果与讨论

2.1 六种氨基酸对紫色红曲霉产红色素的影响

在发酵培养基中添加的氨基酸是经过筛选的6种游离氨基酸(组氨酸、酪氨酸、甘氨酸、谷氨酸、天门冬酰胺、天门冬氨酸)，添加量均为0.20%，与未添加氨基酸的发酵培养基(对照组)做对比，分别检测红曲红色素生成的情况。6种氨基酸合成红色素色价对比情况见表1，6种氨基酸在同浓度下合成红色素色价对比情况见图1。

表1 6种氨基酸合成红色素色价对比情况

图1 6种氨基酸在同浓度下合成红色素色价对比情况

如表1、图1所示，与未添加氨基酸的对照组相比，6种添加氨基酸的试验组在红色素的生成趋势上呈现一致性，随着发酵的进行，红色素生成量逐渐增加，发酵到一定时间，红色素生成量缓慢或者停滞；添加了天门冬酰胺、天门冬氨酸的试验组中红色素生成量峰值，明显高于对照组及其他组，表明这两种氨基酸的添加，会加快红色素合成和积累的速率。特别是在发酵138h，添加了天门冬氨酸实验组生成红色素量比对照组提高60.32%，而天门冬酰胺实验组生成红色素比对照组提高60.59%。在发酵174h时，对照组和氨基酸组合成红色素量都处于停滞或者缓慢衰退。综上所得，发酵时长在138～162h间是合成红色素的最高点，天门冬酰胺和天门冬氨酸这两种氨基酸较其他氨基酸，更适合用于提高红曲红的色价。有研究提及组氨酸[8]对合成红色素也有增强作用，从而进一步探索这两种氨基酸与组氨酸在不同浓度下发酵培养生成红色素的情况。

2.2 不同浓度的氨基酸对紫色红曲霉合成红色素的影响

2.2.1 不同浓度的天门冬酰胺对合成红色素的影响

通过2.1得知添加0.20%的天门冬酰胺比对照组合成红色素提高了60.59%，现添加0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.40%、0.50%这7种不同的浓度到发酵培养基中，筛选出合成红色素最佳的浓度。天门冬酰胺不同浓度合成红色素色价情况见表2，图2。

表2 天门冬酰胺不同浓度合成红色素色价情况

图2 天门冬酰胺不同浓度合成红色素色价(u/mL)情况

如表2、图2所示，随着天门冬酰胺浓度的提高，试验组中红色素生成趋势呈一致性，红色素产量在各发酵时期均随之增加；当天门冬酰胺添加浓度达到0.3%，138h红色素生成量达到659u/mL，峰值比对照组提高了80.05%，增幅最显著；当天门冬酰胺添加浓度继续提高至0.40%时，红色素合成量略有下降，不再继续增加。

2.2.2 不同浓度的天门冬氨酸对合成红色素的影响

通过2.1得知添加0.20%的天门冬氨酸比对照组合成红色素提高了60.32%，现添加0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.40%、0.50%这7种不同的浓度到发酵培养基中，筛选出合成红色素最佳的浓度。天门冬氨酸不同浓度合成红色素色价情况见表3，图3。

表3 天门冬氨酸不同浓度合成红色素色价情况

图3 天门冬氨酸不同浓度合成红色素色价(u/mL)情况

如表3、图3所示，随着天门冬氨酸浓度的提高，试验组中红色素生成趋势呈一致性，红色素产量在各发酵时期基本随之增加；有4个不同浓度的最高点都出现在138h，且差距较小。当添加浓度为0.25%，138h红色素生成量达到623u/mL，比其余3组偏高一点，比对照组提高了66.13%，增幅最显著；当添加浓度继续提高至0.50%或者降低到0.10%，红色素合成量明显下降。

2.2.3 不同浓度的组氨酸对合成红色素的影响

通过2.1得知添加0.20%的组氨酸比对照组合成红色素提高了0.087%，基本不明显，参考已知的文献得知组氨酸在添加量为0.70%时，合成红色素的量最显著。现添加0.20%、0.30%、0.40%、0.50%、0.60%、0.70%、0.80%这7种不同的浓度到发酵培养基中，筛选出合成红色素最佳的浓度。随着组氨酸添加浓度的提高，试验组中红色素生成趋势呈一致性随之增加；当组氨酸添加浓度达到0.70%时，138h红色素生成量峰值比对照组提高了38.3%，增幅最显著；当组氨酸添加浓度继续提高至0.80%时，红色素合成量呈大幅度下降，甚至低于对照组。其原因可能是添加组氨酸抑制了苹果酸的积累，从而增强了红色素的产生[10]；随着添加组氨酸浓度的提高，抑制苹果酸积累的效果逐渐增强，当添加量超过0.80%，出现反馈抑制，红色素产量不再增加，甚至出现大幅度下降。结果见表4。

表4 组氨酸不同浓度合成红色素色价情况

3 结论

在紫色红曲霉菌液态发酵的培养基中添加不同种类的氨基酸，用低浓度进行首轮筛选合成红色素较高的氨基酸，再进行浓度梯度筛选。在6种氨基酸中，天门冬酰胺和天门冬氨酸的试验组中，红色素生成量峰值明显高于对照组及其他组；说明在发酵培养基中，添加这两种氨基酸会加快红色素合成和积累的速率。添加了0.25%天门冬氨酸实验组在138h红色素生成量达到623u/mL，比对照组提高66.13%；添加0.30%天门冬酰胺在138h红色素生成量达到659u/mL，峰值比对照组提高了80.05%。而组氨酸添加浓度达到0.70%，红色素生成量峰值最高比对照组提高了38.3%，还是略低于天门冬酰胺和天门冬氨酸合成红色素的速率。而其他氨基酸则不利于红色素的合成。

研究结果将为探究紫色红曲霉菌液态发酵红曲色素合成机制，以及构建红曲红色素的高产发酵体系提供有益借鉴。