印度梨形孢对非洲菊幼苗生长及抗旱性的影响

陈玮婷，夏朝水，陈昌铭，廖巧玲，曹奕鸯，陈仕朋，郭芸玮

(三明市农业科学研究院 a花卉研究所，b旱地作物研究所，福建 沙县 365500)

非洲菊(GerberajamesoniiL.)又名扶郎花，为菊科大丁草属多年生草本花卉，是世界五大鲜切花之一，具有重要经济观赏价值[7-8]。在实际生产中，非洲菊大多采用露地或简易大棚栽培，冬天的持续低温和夏天的棚内高温等原因均可造成非洲菊干旱或者间歇性干旱，导致非洲菊产量和切花品质下降，造成严重损失[9]。因此，探究改善非洲菊对干旱胁迫适应能力的有效栽培措施十分关键。

印度梨形孢(Piriformosporaindica)是印度科学家Verma在西北部沙漠地区灌木丛根部分离出的一种内生真菌，属于担子菌门层菌纲梨形孢属，其与丛枝菌根真菌的功能特性极为相似，在寄主植物的根际定殖，并产生复杂的互利共生作用，有助于提高植物抵御生物和非生物逆境胁迫的耐受力[10]。相关报道表明，印度梨形孢可以通过影响抗氧化酶系统来减少ROS的形成[11]。水稻幼苗接种印度梨形孢后可降低盐胁迫下叶片的MDA含量，提高抗氧化酶活性及脯氨酸、叶绿素、可溶性糖和可溶性蛋白含量，从而增强水稻幼苗对盐胁迫的耐受性[12]。印度梨形孢与紫花苜蓿共生可以促进干旱胁迫下紫花苜蓿生长，主要是通过刺激SOD、POD、CAT活性和渗透调节物质的累积来抵抗干旱逆境[13]。接种印度梨形孢的棉花通过增强光合作用和促使根系伸长、增粗，侧生根数量增加而促进棉花生长，并且通过维持叶片水分和温度，保持幼苗叶片的色素含量和含水量，维持正常的生理代谢，提高棉花苗期的抗旱性[14]。目前已有大量研究探讨印度梨形孢对植物生长发育的作用，提高不同植物应对非生物和生物胁迫的抗性，包括渗透胁迫、高温胁迫、低温胁迫、病虫害侵染等[15]。但关于印度梨形孢与菊科植物共生及相关渗透胁迫等方面的研究甚少，Chen等[16]初步研究发现，接种印度梨形孢可显著提高非洲菊组培苗耐盐性。在此基础上，本试验进一步探究印度梨形孢对非洲菊幼苗生长及抗旱性的影响，明确印度梨形孢对非洲菊干旱胁迫的调节机理，旨在为花卉的绿色栽培、抗旱性栽培研究提供新思路。

1 材料与方法

1.1 材 料

供试材料为非洲菊(GerberajamesoniiL.)品种‘云南红’，来源于三明市农业科学研究院国家非洲菊种质资源库收集的品种。印度梨形孢(Piriformosporaindica)真菌菌株由台湾大学植物科学研究所叶开温教授提供，三明市农业科学研究院花卉研究所实验室保存。

1.2 试验处理

试验在三明市农业科学研究院作物遗传改良与创新利用实验室进行。

1.2.1 菌悬液的制备 取在PDB液体培养基培养14 d的印度梨形孢菌液，4 ℃、8 000g离心15 min后用ddH2O清洗3遍，加入ddH2O制备菌悬液,将菌悬液搅碎后调节吸光度OD600至0.8备用[17]。

1.2.2 印度梨形孢对非洲菊幼苗生长的影响试验 将非洲菊组培苗接种于生根培养基(0.5 mg/L NAA、0.5 mg/L激动素和质量分数1.5%蔗糖、0.2%活性炭、0.7%琼脂)，21 d后选择长势均匀一致的非洲菊组培苗移栽于直径9 cm、高8 cm的塑料盆中，栽培基质由泥炭土、黄土、珍珠岩按质量比3∶1∶1配成，在25 ℃、相对湿度70%～75%、白天光照12 h的条件下正常培养。试验设处理组(浇灌印度梨形孢菌液)和对照组(浇灌ddH2O，CK)，每个处理24株，每周浇灌50 mL印度梨形孢菌液或ddH2O，共浇灌4次，试验持续30 d。浇灌结束缓苗7 d后进行干旱胁迫试验，将幼苗充分浇透后采用自然干旱处理[1]，设非胁迫处理为对照，14 d后对幼苗完全展开第3片叶进行指标测定，每指标重复3次。

工况一，开挖深度为1.38 m，至第一道内支撑位置；工况二，开挖深度为7.33 m，至第二道内支撑位置；工况三，开挖深度为12.38 m，至第三道内支撑位置；工况四，开挖深度为18.26 m，至基坑底部.

1.2.3 印度梨形孢在非洲菊幼苗根部定殖情况观察 印度梨形孢菌液处理非洲菊幼苗30 d后，采集健康新鲜的根部样本(每样本3个生物学重复)迅速放入液氮，混合均匀后磨样，每份样品称取0.1 g，置于-80 ℃冰箱低温保存。采用Kumar等[18]的染色方法，将根部切片先用体积分数2%氢氧化钾浸泡3 min，体积分数0.05%台盼蓝染色7 min，再用ddH2O缓慢冲洗3～4遍后制片，用BX53光学显微镜(Olympus，Shinjuku，Tokyo，Japan)观察印度梨形孢在非洲菊幼苗根部的定殖情况。

采用Chang等[19]的方法提取非洲菊幼苗根部总RNA，用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Takara Bio Inc.，Shiga，Japan)试剂盒合成cDNA，以印度梨形孢PiTef1基因、非洲菊GjActin为内参基因设计引物进行PCR扩增，引物序列分别为PiTef1-F(5′-GGCCACCGTGACTTTATCAA-GAAC-3′)、PiTef1-R(5′-TTCCTTGACGATTT-CGTTGAAGCG-3′)和GjActin-F(5′-ATGGTGA-ACTCCCACACTCAGAAG-3′)、GjActin-R(5′-CAGGATGAAGATGAGGATGACAAGA-3′)，以鉴定印度梨形孢的定殖情况。

1.3 测定项目及方法

1.3.1 生长指标 印度梨形孢菌液处理非洲菊幼苗30 d后，分别收集2组非洲菊幼苗地上部和根部样品，测定地上部鲜质量、叶片数、叶柄长以及根部鲜质量、根数、根长。

1.3.2 叶绿素荧光参数 取干旱胁迫前后各组非洲菊幼苗叶片，经黑暗条件驯化30 min后，用叶绿素荧光仪Mini-PAM-Ⅱ(WALZ，Germany)测定叶绿素荧光参数，包括PSⅡ最大光化学效率(Fv/Fm)、非光化学淬灭系数(NPQ)、光化学淬灭系数(qP)和表观光合电子传递速率(ETR)。

1.3.3 光合色素含量 取干旱胁迫前后各组非洲菊幼苗叶片，按照Wintermans和Mots[20]的方法提取叶绿素。使用Infinite M200酶标仪(Tecan，Switzerland)在665和649 nm下测定吸光度，计算叶绿素a、叶绿素b和叶绿素总量；类胡萝卜素含量测定采用Sumanta等[21]的方法，以甲醇萃取叶片上清液，使用Infinite M200酶标仪(Tecan，Switzerland)测定470，652和665 nm下的吸光度，计算类胡萝卜素(Caroteniods)含量。

1.3.4 相对含水量和含水量 取干旱胁迫前后各组非洲菊幼苗叶片，测定鲜质量，然后在65 ℃烘箱中烘2 d后测定干质量。计算相对含水量和含水量。

1.3.5 气孔观察 采取指甲油印痕法[22]，将指甲油均匀涂抹在植物下表皮，静置10 min后剪取透明胶带黏贴于叶片上，撕下透明胶带并置于载玻片，在显微镜下选取3个视野进行观察，统计保卫细胞弯曲角度，计算气孔开放度。

1.3.6 抗氧化酶活性 CAT活性采用紫外吸收法[23]测定，APX活性参照Nakano和Asada[24]的方法测定，POD活性采用愈创木酚法[25]测定，SOD活性采用SOD活性检测试剂盒(Solarbio)测定。

1.3.7 MDA含量测定 MDA含量采用MDA含量检测试剂盒(Solarbio)测定。

1.4 数据分析

采用Excel 2010对试验数据进行处理和分析，采用t-test检验干旱胁迫处理下非洲菊幼苗指标差异显著性(P<0.05)。利用Excel 2010软件制图，图表中数据均为“平均值±标准差”。

2 结果与分析

2.1 印度梨形孢对非洲菊幼苗生长的影响

观察发现，用印度梨形孢菌液处理非洲菊幼苗30 d后，处理组非洲菊幼苗比对照组更粗壮、叶片更绿、生长更旺盛。由表1可知，处理组非洲菊幼苗地上部鲜质量为3.29 g/株，较对照组极显著增加85.00%(P<0.01)；处理组非洲菊幼苗叶片数和根数分别较对照组显著增加12.50%和25.00%(P<0.05)；处理组非洲菊幼苗叶柄长16.29 cm，较对照组极显著提高46.23%；处理组非洲菊幼苗根部鲜质量为0.46 g/株，是对照组的1.92倍；处理组非洲菊幼苗根长为16.39 cm，极显著高于对照组(P<0.01)。可见印度梨形孢能促进非洲菊幼苗生长。

表1 印度梨形孢对非洲菊幼苗生长的影响Table 1 Effects of Piriformospora indica treatment on growth of gerbera seedlings

2.2 印度梨形孢在非洲菊幼苗根部的定殖

用印度梨形孢菌液处理非洲菊幼苗30 d后，取根部组织进行台盼蓝染色，在光学显微镜下观察定殖情况。结果(图1)表明，印度梨形孢的孢子定殖于非洲菊幼苗根部细胞内，其孢子呈蓝色梨形状。

图1 印度梨形孢在非洲菊根部的定殖情况(×400)Fig.1 Colonization of Piriformospora indica on gerbera roots after co-cultivation(×400)

对印度梨形孢PiTef1基因进行RT-PCR，如图2所示，仅在处理组非洲菊幼苗根部检测到PiTef1基因，进一步证实印度梨形孢已成功定殖于非洲菊根部。

图2 印度梨形孢在非洲菊根部定殖的PCR鉴定Fig.2 PCR identification of the colonization of Piriformospora indica in roots of gerbera seedlings

2.3 干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊幼苗生长的影响

由图3可知，干旱胁迫14 d后，对照组非洲菊幼苗叶片出现了严重萎蔫与褪绿，处理组非洲菊幼苗叶片轻微下垂，褪绿现象不明显。

图3 干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊幼苗生长的影响Fig.3 Effects of Piriformospora indica treatment on growth of gerbera seedlings under drought stress

2.4 干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊幼苗叶绿素荧光参数的影响

叶绿素荧光参数是代表植物光合生理与逆境胁迫关系的重要参数。由图4可知，在未胁迫情况下，处理组非洲菊幼苗叶片叶绿素荧光参数与对照组均无显著差异(P>0.05)。在干旱胁迫下，处理组非洲菊幼苗叶片的Fv/Fm和qP分别为0.825和0.655，均显著高于对照组(P<0.05)，说明印度梨形孢能保护非洲菊光系统反应中心，缓解干旱胁迫对非洲菊幼苗造成的光抑制；而处理组非洲菊幼苗叶片的NPQ和ETR均与对照组无显著差异(P>0.05)。

* 表示与对照组相比在P<0.05水平差异显著，** 表示与对照组相比在P<0.01水平差异极显著。下同 * indicates significant differences at P<0.05 level and ** indicates significant differences at P<0.01 level.The same below图4 干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊幼苗叶绿素荧光参数的影响Fig.4 Effects of Piriformospora indica on chlorophyll fluorescence parameters of gerbera seedlings under drought stress

2.5 干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊幼苗叶片光合色素的影响

叶绿素和类胡萝卜素是光化学反应的2种主要光合色素，其对光合作用至关重要，干旱胁迫会导致光合色素的降解。干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊叶片光合色素的影响见图5。

图5 干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊叶片光合色素的影响Fig.5 Effects of Piriformospora indica on photosynthetic pigments of gerbera leaves under drought stress

由图5可知，在未胁迫情况下，处理组非洲菊幼苗叶片中叶绿素和类胡萝卜素含量与对照组均无显著差异(P>0.05)。在干旱胁迫下，处理组非洲菊幼苗叶片中的叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量分别为0.93，0.44和1.36 mg/g，均与对照组差异显著(P<0.05)；对照组与处理组非洲菊幼苗叶片中的类胡萝卜素含量分别为10.83和12.64 mg/g，差异不显著(P>0.05)。说明在干旱胁迫下，印度梨形孢可能是通过减缓叶片细胞中叶绿素降解，减少干旱对光合作用的损伤。

2.6 干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊幼苗叶片相对含水量和含水量的影响

干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊幼苗相对含水量和含水量的影响见图6。

图6 干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊幼苗相对含水量和含水量的影响Fig.6 Effects of Piriformospora indica on relative water content and water content of gerbera seedlings under drought stress

叶片含水量能直接反映植物水分盈亏程度和植物的保水能力，是植物抗旱能力的重要依据。由图6可知，在未胁迫情况下，处理组非洲菊幼苗叶片中相对含水量、含水量与对照组均无显著差异(P>0.05)。在干旱胁迫下，处理组和对照组非洲菊幼苗叶片中相对含水量分别为33.73%和21.82%，处理组非洲菊幼苗叶片相对含水量较对照组显著增加54.60%(P<0.05)；处理组和对照组非洲菊幼苗叶片中含水量分别为73.70%和44.40%，二者差异极显著(P<0.01)。说明在干旱胁迫下印度梨形孢可提高非洲菊幼苗叶片的保水能力。

2.7 干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊幼苗叶片气孔的影响

气孔的调节能力是影响植物干旱胁迫防御的重要因素。通过光学显微镜观察干旱胁迫前后处理组和对照组非洲菊幼苗叶片气孔开闭情况，结果见图7和图8。

图7 干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊气孔开闭的影响图8 干旱胁迫下非洲菊幼苗叶片的气孔开放度 Fig.7 Effects of Piriformospora indica on stomatal apertures of gerbera seedlings under drought stress Fig.8 Stomatal apertures of gerbera seedlings leaves of Piriformospora indica under drought stress

由图7和图8可以看出，在未胁迫情况下，处理组与对照组非洲菊幼苗叶片气孔开放度差异不显著(P>0.05)；在干旱胁迫下，处理组与对照组非洲菊幼苗叶片气孔开放度分别为148.03°和147.47°，也无显著差异(P>0.05)。说明在干旱胁迫下处理组和对照组非洲菊幼苗叶片气孔均处于微张状态。

2.8 干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊幼苗抗氧化酶活性和MDA含量的影响

干旱胁迫下植物体内的抗氧化酶相互协同作用，以抵抗活性氧造成的毒害。由表2可知，在未胁迫情况下，处理组非洲菊幼苗叶片中抗氧化酶活性、丙二醛含量与对照组均无显著差异(P>0.05)。在干旱胁迫下，处理组非洲菊幼苗叶片中CAT、SOD活性与对照组均无显著差异(P>0.05)；处理组非洲菊幼苗叶片中APX活性为对照组的6.46倍(P<0.01)，而POD活性显著低于对照组(P<0.05)。

MDA是膜脂过氧化作用的产物之一，是膜损伤程度的主要指标。由表2可见，在干旱胁迫下，处理组非洲菊叶片中MDA含量较对照组显著减少33.02%(P<0.05)。说明印度梨形孢可有效降低非洲菊膜脂过氧化程度，增强幼苗对干旱胁迫的耐受能力。

表2 干旱胁迫下印度梨形孢对非洲菊幼苗叶片抗氧化酶活性和MDA含量的影响Table 2 Effects of Piriformospora indica on anti-oxidative enzyme activities and MDA content in leaves of gerbera seedlings under drought stress

3 讨 论

印度梨形孢对宿主植物的促生作用已在多种植物中被证实，如用印度梨形孢定殖甘薯后可以提高甘薯叶片光合色素含量和光合效率，进而提高其地上部和地下部的生物量[17]；也有报道指出，印度梨形孢可定殖于文心兰根部，促进文心兰生长量及根的形成[26]。本研究中，处理组非洲菊幼苗地上部鲜质量、叶片数、叶柄长以及根部鲜质量、根数、根长均显著增加，这与前人研究结果[16]一致，说明印度梨形孢对非洲菊生长具有促进作用。

印度梨形孢对黑麦草的侵染未显著改变叶绿素荧光参数NPQ、PSⅡ非调节性能量耗散(YNO)、PSⅡ调节性能量耗散(YN-PQ)和ETR，但显著提高了PSⅡ的实际光合量子产量(Y(Ⅱ))和qP，说明印度梨形孢提高了黑麦草叶片对光能的转化及利用效率[27]，这与本研究在干旱胁迫下经印度梨形孢处理的非洲菊幼苗叶片中的Fv/Fm、qP显著升高结果相似，说明在干旱胁迫下印度梨形孢定殖的非洲菊幼苗能更多地将吸收的光能用于光化学反应，从而提高光能利用效率，缓解干旱对光合机构的损伤。叶绿素反映植物光合能力，类胡萝卜素具有吸收、传递光能及光保护功能，同时可反映植物受胁迫情况[28]。本研究中，干旱胁迫下处理组非洲菊幼苗叶片中叶绿素a、叶绿素b、叶绿素总量均显著高于对照组，说明在干旱胁迫下印度梨形孢能够缓解非洲菊幼苗叶片叶绿素的降解，在一定程度上保护光合系统，这与在芝麻[29]、烟草[30]上的研究结果一致。干旱胁迫下，处理组非洲菊幼苗叶片中含水量、相对含水量显著高于对照组，说明印度梨形孢可以显著提高非洲菊植株叶片的保水能力，减轻干旱引起的水分胁迫。然而，气孔观察结果显示，处理组非洲菊幼苗叶片气孔开放度与对照组无显著差异，均处于开放状态，因此推测，印度梨形孢提高非洲菊幼苗抗旱能力可能与气孔开合调节机制无关。

本研究中，在干旱胁迫条件下印度梨形孢定殖能极显著提升非洲菊幼苗叶片的APX活性。研究表明，干旱胁迫下3种百合花APX活性稳定增长并在后期依然保持较高活性，说明APX是百合受到干旱胁迫时的主要抗氧化酶[6]。任婧瑶等[31]发现，耐旱花生品种中APX活性显著高于不耐旱花生品种，推测APX在花生耐旱能力上具有重要作用，是调节花生植株活性氧平衡的重要保护酶。当植物受到干旱胁迫时，膜脂发生过氧化损伤且MDA含量显著上升，MDA作为脂质过氧化的产物，被认为是干旱引起氧化损伤的重要指标[32]。本研究结果显示，在干旱胁迫下，印度梨形孢可显著降低非洲菊幼苗叶片MDA含量，说明印度梨形孢能减轻膜脂过氧化程度，缓解干旱胁迫带来的负面影响，在大白菜[33]、油菜[34]中也有相似结果。综上所述，本研究发现干旱胁迫下印度梨形孢可提高非洲菊APX活性, 有效降低干旱胁迫下过氧化物积累，从而提高非洲菊幼苗的抗旱能力。另外，印度梨形孢提高非洲菊抗旱性的作用也可能是通过提高光合系统效率或提高渗透物质含量、调节离子平衡等[35]实现的。有关印度梨形孢提高非洲菊幼苗耐旱性的复杂机理仍需要进一步深入研究。