胰高血糖素样肽1通过circRNADOCK1/miR-132-3p信号轴调控胰岛β细胞分泌功能的研究

胡金华 王婧 汪日红 卓莉莉 张秋玲

2型糖尿病是常见的慢性疾病，据调查研究显示2017年全球糖尿病患者已高达4.51亿，给个人生活质量及社会医疗带来了严重负担［1-2］。目前已有充分的证据显示，胰岛β细胞受损在2型糖尿病发病中扮演重要角色［3-4］，因此采取有效的治疗药物改善胰岛β细胞分泌。GLP-1类似物可一定程度上促进机体胰岛素的释放，改善胰岛β细胞的功能［5］，但具体涉及的作用机制尚不明确。目前已发现其可通过调控非编码RNA miR-132表达水平提升胰岛β细胞中的葡萄糖和GLP-1诱导的胰岛素分泌，影响胰岛功能［6］。环状RNA（circular RNA，circRNA）是一大类共价闭合环状非编码RNA，不受核酸外切酶的影响而具有高度稳定性。课题组前期对糖尿病大鼠胰腺细胞组织进行circRNA表达谱分析，发现circRNADOCK1呈异常表达，与其他circRNA类似，其具有海绵样吸附作用，含有miRNA结合位点，可作为竞争性内源RNA调控下游miRNA表达。本研究将围绕这个问题进一步了解GLP-1类似物改善胰岛功能的作用机制，为防治2型糖尿病提供新的研究思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料 艾塞那肽（美国MCE公司）；大鼠胰岛β细胞系INS-1细胞（美国ATCC公司）；胎牛血清和RPMI-1640（美国Gibco公司）；胰岛素检测试剂盒（北京北方生物技术研究所）；RNA提取试剂Trizol、DMSO、DEPC水、Lipofectamine 2,000（美国Invitrogen公司）；SYBR Premix Ex Taq qPCR试剂盒（日本Takara公司）；CCK-8检测试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司）；引物（上海生物工程公司）；荧光素酶报告基因检测试剂盒（Prome公司）；circRNADOCK1过表达载体（广州自吉赛生物公司）；siRNA-circRNADOCK1（锐博生物公司）。

1.2 实验方法 （1）细胞培养及分组：将INS-1细胞培养在RPMI-1640培养基，37℃、5% CO2、21% O2气体的恒温恒湿环境中。25 mmoL/L的葡萄糖处理INS-1细胞24 h后将细胞分为6组：①对照组：不做任何处理；②GLP-1类似物组：给予GLP-1类似物艾塞那肽处理48 h；③circRNADOCK1 siRNA组：转染circRNADOCK1siRNA，干扰表达；④circRNADOCK1过表达组：转染过表达circRNADOCK1载体，上调circRNADOCK1表达；⑤GLP-1类似物+circRNADOCK1 siRNA组：先 用 艾 塞 那 肽 处 理48 h，再 转 染circRNADOCK1siRNA；⑥GLP-1类似物+circRNADO CK1过表达组：先用艾塞那肽处理48 h，再转染过表达circRNADOCK1载体。（2）GLP-1类似物处理细胞：加入100 nmol/L艾塞那肽10 μL至高糖处理后的INS-1细胞，培养48 h后，进行后续实验。（3）circRNADOCK1过表达载体转染：过表达circRNADOCK1的慢病毒载体及空载体，采用感染复数（MOI）=20作为转染条件，取INS-1细胞铺于96孔培养板，每组设3个重复孔。circRNADOCK1过表达慢病毒经扩增、鉴定、纯化后用于后续实验，待细胞长至80%时，培养24 h后弃培养液，然后吸出培养液，加入circRNADOCK1过表达慢病毒或空白载体慢病毒转染液，在37 ℃、5%CO2、21%O2的细胞孵箱培养1 h后弃转染液后继续培养48 h。（4）circRNADOCK1 siRNA转染：待细胞汇合度达50%时用于细胞转染，将circRNADOCK1 siRNA与si-NC转染质粒按转染说明分别转染于INS-1细胞中，置于37℃、5%CO2培养箱中继续培养48 h后，收集细胞。（5）氯化钾刺激的胰岛素分泌（KSIS）功能实验及胰岛素测定：经不同处理后的细胞先弃去培养上清，用PBS漂洗一次，加入KRBH缓冲液（krebs-ringer bicarbonate HEPES Buffer）培养1 h；弃去上清，INS-1细胞中加入含有3.3 mmol/L（低糖）或者50.0 mmoL/L KCl（高钾）的KRBH缓冲液，孵育1 h，收集上清，待测；PBS再漂洗一次，每孔细胞加入200 μL酸乙醇，4 ℃抽提过夜，取上清用于检测；放免法（RIA）用试剂盒检测各组细胞胰岛素水平。（6）CCK-8实验检测细胞增殖：取各组处理后处于对数生长期的INS-1细胞，以每孔1,000个细胞接种于96孔板中，并分别在0、6、12、24、36、48 h时间点加入CCK-8试剂，37 ℃环境中孵育1 h，荧光酶标仪在450 nm条件下测定吸光度（A）值，绘制生长曲线。（7）实时定量PCR检测circRNADOCK1和miR-132-3p表达：Trizol法提取细胞RNA，测定浓度和纯度，逆转录合成，以β-actin为内参照，将cDNA模板、SYBR Green预混液、上/下游引物、ddH2O配制成PCR反应溶液，置于Real-time PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：95 ℃ 5 min预变性，然后按95℃ 30 s、60 ℃ 1 min、72 ℃ 1 min、共40个循环，最后72 ℃延伸5 min。通过2-△△CT法分析基因相对表达量。PCR引物序列，见表1。（8）双荧光素酶报告实验：以pGL3-promoter为载体，构建包含circRNADOCK1与miR-132-3p潜在结合序列的重组质粒pGL3-circRNADOCK1和包含相应结合序列突变的pGL3-circRNADOCK1-mut，将重组质粒和miR-132-3p共转染至INS-1细胞中，根据萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶荧光强度比值（FL/RL）的改变判断circRNADOCK1与miR-132-3p是否存在结合作用。

表1 引物序列

1.3 统计学方法 采用SPSS22.0统计软件。计量资料符合正态分布以（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析进行检验；两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组细胞KSIS功能比较 与对照组比较，GLP-1类似物组与circRNADOCK1 siRNA组细胞的KSIS功能明显上升（P＜0.05），circRNADOCK1过表达组明显下降（P＜0.05）；与GLP-1类似物组与circRNADOCK1 siRNA组比较，GLP-1类似物+circRNADOCK1 siRNA组增加更为明显（P＜0.05）；与circRNADOCK1过表达组比较，GLP-1类似物+circRNADOCK1过表达组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

图1 各组细胞KSIS功能比较

2.2 各组细胞胰岛素含量比较 与对照组比较，GLP-1类似物组与circRNADOCK1 siRNA组胰岛素含量明显上升（P＜0.05），circRNADOCK1过表达组明显下降（P＜0.05）；与GLP-1类似物组与circRNADOCK1 siRNA组比较，GLP-1类似物+circRNADOCK1 siRNA组增加更为明显（P＜0.05）；与circRNADOCK1过表达组比较，GLP-1类似物+circRNADOCK1过表达组明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图2 各组细胞胰岛素含量比较

2.3 各组细胞增殖率比较 与对照组比较，GLP-1类似物组与circRNADOCK1 siRNA组增殖率明显增加（P＜0.05），circRNADOCK1过表达组明显下降（P＜0.05）；与GLP-1类似物组与circRNADOCK1 siRNA组比较，GLP-1类似物+circRNADOCK1 siRNA组增加更为明显（P＜0.05）；与circRNADOCK1 过表达组比较，GLP-1类似物+circRNADOCK1过表达组明显增加（P＜0.05）。见图3。

图3 各组细胞增殖率比较

2.4 各组circRNADOCK1 mRNA和miR-132-3p mRNA表达 与对照组比较，GLP-1类似物组与circ RNADOCK1 siRNA组的circRNADOCK表达明显下降，miR-132-3p表达明显增加（P＜0.05），circRNADOCK1过表达组circRNADOCK表达明显增加，miR-132-3p表达明显降低（P＜0.05）；与GLP-1类似物组与circRNADOCK1 siRNA组比较，GLP-1类似物+circRNADOCK1 siRNA组circRNADOCK表达下降更为明显，miR-132-3p表达增加更为明显（P＜0.05）；与circRNADOCK1过表达组比较，GLP-1类似物+circRNADOCK1过表达组circRNADOCK表达明显下降，miR-132-3p表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图4。

图4 各组circRNADOCK1 mRNA和miR-132-3p mRNA相对表达量

2.5 双荧光素酶报告实验验证circRNADOCK1与miR-132-3p的结合作用 双荧光素酶报告实验结果显示，与pGL3-circRNADOCK1-MUT重组质粒比较，pGL3-circRNADOCK1-WT的细胞FL/RL值显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图5。

图5 双荧光素酶报告实验

3 讨论

2型糖尿病是遗传和环境因素共同作用的内分泌代谢疾病，其主要病因是胰岛β细胞受损导致机体胰岛素抵抗。因此，修复受损胰岛β细胞是治疗2型糖尿病的基础。随着GLP-1类似物的逐渐应用，其在临床上受到广泛关注，主要通过与胰腺β细胞中表达的GLP-1受体结合对β细胞发挥调控作用。然而，GLP-1类似物调控β细胞功能中的下游分子机制仍有待充分理解。

随着非编码RNA的不断发现和阐明，其在胰岛β细胞中的功能和机制逐步被揭示，以胰岛β细胞为中心的miRNAs和环状RNA的表达调控网络逐渐丰富［7-8］。研究发现，在肿瘤细胞中circRNADOCK1发挥海绵吸附作用，与miR-132具有结合位点，通过调控其表达发挥促癌作用，细胞分裂贡献者（DOCK）家族成员，circRNADOCK1在肿瘤的发生和发展中其关键作用［9-11］。笔者前期研究发现，糖尿病大鼠胰腺细胞circRNADOCK1表达异常升高，但其在GLP-1调控miR-132的过程中发挥何种作用尚未研究报道，故本研究采用高糖刺激大鼠INS-1细胞模拟胰岛细胞受损，随后采用不同干预手段，分析其对胰岛分泌功能和胰岛素的影响。结果显示，艾塞那肽和circRNADOCK1 siRNA提升细胞KSIS功能和胰岛素含量，而circRNADOCK1 oeRNA则降低细胞KSIS功能和胰岛素含量。初步表明circRNADOCK1升高在胰岛β细胞功能受损中的作用，而降低其表达有助于改善胰岛β细胞功能。但至此，仍不清楚GLP-1与circRNADOCK1的调控关系，为了进一步明确两者的作用，本研究在上述干预基础上采用功能回复实验，即在干扰和过表达circRNADOCK1的基础上分别联合艾塞那肽。结果显示，干扰circRNADOCK1和艾塞那肽共处理后，细胞胰岛分泌功能和胰岛素增加更为明显，而circRNADOCK1过表达与艾塞那肽共处理后，明显逆转circRNADOCK1过表达引起的降低和艾塞那肽的升高；同时实时荧光定量PCR检测的circRNADOCK1和miR-132-3p mRNA表达结果则是进一步验证了GLP-1与circRNADOCK1，这充分表明GLP-1与circRNADOCK1存在直接的调控作用，且可通过circRNADOCK1调控miR-132-3p表达。双荧光素酶报告实验则验证了circRNADOCK1与miR-132-3p具有结合位点。

综上所述，胰高血糖素样肽1（GLP-1）通过circRNADOCK1/miR-132-3p信号轴调控胰岛β细胞分泌功能。在下一步工作中，课题组将继续深入研究相关机制，为2型糖尿病的防治提供新的思路。