氮肥对控制大豆孢囊线虫病危害的影响

贾建平，李金鸿，于敬文，余曦玥，彭德良，李惠霞，黄文坤

(1.甘肃农业大学 植物保护学院，甘肃 兰州 730070；2.中国农业科学院 植物保护研究所，植物病虫害生物学国家重点实验室，北京 100193)

大豆是世界范围内种植最多的豆科作物，是优质植物油料来源和食用、饲用蛋白质主要来源[1]。在2020—2021年，我国进口大豆数量占世界大豆总进口数量的60%，食用大豆约7 440万t[2]。鉴于大豆严重依赖进口，加强我国大豆主要病害防治，提高单产水平，对于振兴我国大豆产业具有十分重要的意义。大豆孢囊线虫(Soybean cyst nematode，SCN，HeteroderaglycinesIchinohe)是危害大豆主要病原之一[3-4]，最早于1899年由雅切夫斯基等在我国东北地区发现并报道，随后在亚洲(朝鲜、印度尼西亚、韩国)、非洲(埃及)、欧洲(俄罗斯)和美洲(哥伦比亚、加拿大、巴西、阿根廷、美国)等地区报道[5-7]。大豆孢囊线虫繁衍周期短，繁殖能力强，1 a可繁殖3代；当环境条件不适宜生长时，土壤中的孢囊可保持10 a的生活力，因此，防治较为困难[8]。1996—2016年，美国仅由该线虫造成的经济损失累计超过320亿美元，平均每年超过15亿美元[9]。在我国，大豆孢囊线虫病发生面积常年在1.33×106hm2，东北和黄淮海地区发生最普遍[10]，东北地区大豆孢囊线虫平均发病率高达80%，平均病情指数在50左右[11]，严重地块减产30%～50%，甚至绝收[12-13]。目前，我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、北京、河南、河北、山东、山西、安徽、江苏、湖北、浙江、上海、新疆、陕西、宁夏和甘肃等18个省、市和自治区已证实有大豆孢囊线虫分布[14-16]。近年来在山西地区首次报道了该线虫侵染绿豆致病并形成孢囊[17]。目前，除了采用抗病品种之外，植物线虫病的防治仍以化学防治为主，但环境污染、抗药性问题仍不容忽视，许多高毒高残留的化学杀线虫剂如溴甲烷、呋喃丹等已被禁用，因此，寻求低毒、低残留、对环境友好的杀虫防治方法成为人们关注的热点。

研究表明，施用氮肥可使大豆产量平均增加11%[18]。作物产量并不随施氮量的增加而持续增加，过量施氮反而会引起氮肥利用率和增产效应降低、氮素损失量增加、土壤酸化加剧等问题[19]。施氮量与产量构成之间呈显著的二次回归关系，各产量构成变化随施氮量的增加出现了“低—高—低”的变化趋势，说明氮肥对产量构成的贡献存在临界值，这个临界值由植物的生理特性决定[20]。氮肥施用量与水稻产量呈开口向下的抛物线关系[21]，朱桂玉等[22]研究发现，氮、磷、钾肥施用量均为中等水平时，水稻产量和经济效益最佳。胥雅馨等[23]研究发现，随着施氮量的增加，根瘤数、根瘤干质量、干物质积累量及产量均表现为先增加后下降趋势。刘志强等[24]研究发现，大豆蛋白质含量随着氮用量的增加呈先升高再下降的变化趋势。大豆孢囊线虫病属于土传病害，其发生与土壤环境作用密切相关，施肥会引起土壤pH值的改变，大豆根在低pH值条件下可形成较厚的木栓层，具有防止线虫感染的作用[25]。植物生长过程中从根部不同部位分泌到土壤中各种物质，张福锁等[26]认为，根系分泌物主要包含糖、氨基酸、有机酸、维生素、核苷酸、真菌刺激剂或引诱剂、线虫孵化剂、线虫引诱剂和其他混合物等。阎飞等[27]研究表明，大豆的根系分泌物主要为类黄酮、异黄酮和酚类，可诱导根瘤菌在根部定植[28-31]。Tefft等[32]研究认为，大豆根系分泌物可能导致更多的SCN卵孵化。Sikora等[33]研究发现，不同大豆品种的淋溶液对大豆孢囊线虫卵孵化刺激程度存在着差异。Schmitt等[34]研究认为，大豆根系分泌物比裸露土壤更能刺激大豆孢囊线虫卵的孵化。施用氮肥，对大豆和孢囊线虫均会产生影响，因此，有必要研究不同氮肥水平对大豆生长及孢囊线虫的影响，以便为氮肥在大豆生产和孢囊线虫病防治中的合理利用提供依据。

本试验拟设置不同的氮肥水平，分析其土壤淋溶液和根系浸出液对孢囊线虫的直接影响，并通过室内试验和田间试验，探究施氮水平对孢囊线虫危害和对大豆生长的影响，以期为通过农业措施防治大豆孢囊线虫病提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试大豆品种为中黄30号(市售感病品种)。

供试大豆孢囊线虫采集自甘肃省平凉市大豆田。

供试氮肥为尿素(46%CH4N20)(陕西渭河重化工有限责任公司)。

盆栽试验土壤理化性质：将土和细沙按2∶1的比例混合后灭菌，其碱解氮、有效磷和速效钾的含量分别为57.5，19.0 ，117 mg/kg。

1.2 土壤淋溶液和根系浸出液的制备

试验用塑料盆为8 cm×8 cm，内盛150 g土，每盆种植1株大豆。大豆长出2片子叶时施肥(施肥量见表1)，对照组不施肥，15 d后收集土壤淋溶液[30]。收集淋溶液时，提前24 h停止浇水，每盆用50 mL蒸馏水浸润土壤，1 h后再浇灌150 mL蒸馏水，收集50 mL盆底部渗出的溶液，用滤纸过滤备用[35]，重复3次。

表1 盆栽试验中的氮肥施用水平Tab.1 Nitrogen fertilization level in pot experiment

为了收集根系浸出液，将上述施肥处理15 d后的植株拔出并保留完整的大豆根部，用清水冲洗干净。将根剪碎后浸入50 mL蒸馏水中，在常温下浸泡24 h，得到不同浓度氮肥处理后的根系浸出液[36]。

1.3 大豆孢囊线虫卵悬浮液的制备

大豆收获后，参考李惠霞等[37]的调查方法，选择孢囊线虫基数较高的大豆田块收集病土，采用漂浮法分离收集孢囊。将挑取的孢囊置于75，30 μm套筛上，用橡胶塞充分研磨破碎，然后用蒸馏水将30 μm筛上的卵冲洗至烧杯中，制成200粒/mL的卵悬浮液备用[36]。

1.4 土壤淋溶液和根系浸出液对卵孵化的影响

将自制的小筛网置于直径3.5 cm的培养皿内，加入1 mL卵悬浮液，按1.2中方法制备3 mL不同浓度的土壤淋溶液和根系浸出液，对照组则加入等量蒸馏水，放入25 ℃培养箱中孵化。每处理重复3次，每隔3 d统计二龄幼虫孵化情况，共记录12 d，计算卵孵化抑制率。

卵孵化抑制率=(对照组卵孵化率-处理组卵孵化率)/对照组卵孵化率×100%

①

1.5 盆栽试验中施用氮肥对线虫繁殖的影响

大豆孢囊线虫繁殖试验所用塑料盆为10 cm×15 cm，内盛250 g土，每盆播种1粒大豆，种植前各处理施用0.016～0.064 g/kg土的氮肥(表1)，对照组不施肥。大豆2叶期，用5 mL枪头在大豆根周围对称打孔，深度约为3 cm，每株大豆接2 000粒卵，每个处理重复3次。将大豆植株置于22～28 ℃且光照条件良好的环境中培育，定期浇水。接种70 d后，收集土样，采用漂浮法分离收集孢囊，在解剖镜下计数[37]，计算孢囊相对减退率。

孢囊相对减退率=(对照组孢囊数-处理组孢囊数)/对照组孢囊数×100%

②

1.6 田间试验中不同浓度氮肥对线虫繁殖和大豆生长的影响

试验地为甘肃省庆阳市宁县良平镇丰乐村多茬种植大豆的田块，且大豆孢囊线虫基数较高。大豆于2020年5月3日种植，9月25日收获。大豆生长期进行除草和喷施农药，自然雨水灌溉。

设置22.50～78.75 kg/hm24个氮肥浓度梯度，空白对照未施肥(表2)。每个小区面积为6 m2，重复3次，各处理随机排列。大豆播种前，调查各处理孢囊基数；大豆开花期，挖取20株大豆的全部根系，计算发病株率。大豆收获时，挖取20株大豆，用清水冲洗后，统计株高、根长、荚数、荚粒数和千粒质量等，比较氮肥对植株生长的影响。参照李惠霞等[37]的调查方法，采集小区内0～20 cm的土壤，采用漂浮法分离收集孢囊，在解剖镜下计数，统计各小区的孢囊减退率。

孢囊减退率=(施药前小区孢囊数-施药后小区孢囊数)/施药前小区孢囊数×100%

③

表2 田间试验氮肥水平Tab.2 Nitrogen fertilization level in field experiment

1.7 数据分析

采用Excel 2013进行数据处理和作图，并用SPSS 22.0软件进行相关分析，差异显著性采用Duncan′s新复极差法进行检验。

2 结果与分析

2.1 土壤淋溶液和根系浸出液对大豆孢囊线虫卵孵化的影响

在处理12 d内，施氮的土壤淋溶液处理均能显著抑制大豆孢囊线虫的卵孵化，但不同浓度氮肥土壤淋溶液处理SCN卵孵化抑制率无显著差异。处理6 d，1.0(0.032 g/kg)，1.5(0.048 g/kg)，2.0倍(0.06 4g/kg)N肥处理土壤淋溶液处理的卵孵化抑制率无显著差异；处理12 d，1.0(0.032 g/kg)，2.0倍(0.064 g/kg)N肥处理的卵孵化抑制率分别为34.21%，29.31%，且有显著性差异(P<0.05)(图1)。

根系浸出液中对卵孵化抑制率影响的调查结果表明，整个时间段各处理浓度根系浸出液均对大豆孢囊线虫卵孵化具有一定的抑制作用。在孵化至第12天，各处理孵化抑制率分别为50.47%，49.53%，29.91%，55.09%(图2)。2倍氮肥处理(0.064 g/kg)的根系浸出液中SCN卵孵化抑制率在各个观察时间均高于其他处理，说明2倍氮肥处理的根系浸出液对线虫卵孵化有显著的抑制作用。

图1 施氮肥后的土壤淋溶液对SCN卵孵化的影响Fig.1 The effect of soil leaching solution on the hatching of SCN eggs

图2 施氮肥大豆根系浸出液对SCN卵孵化的影响Fig.2 Effect of soybean root extraction with nitrogen fertilizer on the hatching of SCN eggs

2.2 盆栽试验中氮肥处理对大豆孢囊线虫繁殖的影响

盆栽试验中，接种孢囊线虫90 d后，不同的氮肥处理均可有效地减少孢囊的数量，其孢囊相对减退率分别为10.00%，4.24%，28. 78%，16.81%，且差异均达显著水平(P<0.05)，其中1.5倍(0.048 g/kg)氮肥处理的孢囊相对减退率最高，达28.78%(图3)。表明氮肥处理对大豆孢囊线虫的繁殖具有一定的抑制作用。

图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。图4同。 Different letters indicate significant difference (P<0.05).The same as Fig.4.

2.3 田间试验氮肥处理对大豆孢囊线虫繁殖和大豆生长的影响

大豆开花期调查，与对照相比，1.25，1.50倍氮肥处理，可以显著减少大豆的病株率(P<0.05)，但0.50，1.75倍氮肥处理与对照相比病株率没有显著差异(表3)。与对照相比，1.25，1.50，1.75倍氮肥处理的千粒质量均显著提高，其中施用1.25倍 (56.25 kg/hm2) 氮肥小区增产率最高，达14.75%；氮肥处理的荚粒数与对照没有显著差异，但株高显著高于未施肥的对照。因此，适当增施氮肥，不仅可以减少大豆孢囊的危害，而且可以增加大豆的产量。

表3 田间施氮肥对大豆生长和产量的影响Tab.3 Effect of nitrogen fertilizer application on soybean growth and yield in the field experiment

大豆收获时，采集根围的土壤分离大豆孢囊线虫的孢囊，分析氮肥处理对大豆孢囊线虫繁殖的影响。结果表明，氮肥各处理的孢囊数量均显著下降，孢囊减退率为13.62%～25.29%，其中1.25倍(56.25 kg/hm2)N肥处理的孢囊减退率最高，而对照小区土壤中的孢囊数较大豆播种前增加了30.77百分点(图4)。说明适当增施氮肥能够有效减少大豆孢囊线虫的繁殖。

图4 田间施氮肥对土壤中大豆孢囊线虫的影响Fig.4 Effect of nitrogen fertilizer application on soybean cyst nematode in field experiment

3 结论与讨论

本研究通过室内接种试验和田间试验，发现氮肥土壤淋溶液及大豆根系浸出液可不同程度地抑制大豆孢囊线虫卵的孵化，田间适量增施氮肥可以减轻大豆孢囊线虫病的危害，增加大豆产量。因此，适量增施氮肥对于提高大豆的抗病性、减少大豆孢囊线虫病的危害具有重要意义。适量增施氮肥，不仅可以通过减少根系分泌物来降低对线虫的诱集作用，而且可以促进植株中抗病性相关物质的增加，从而增强植株对线虫的抗性、降低线虫的侵染和危害。前人研究表明，易感作物根系分泌物如谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸和苯丙氨酸等都对线虫具有诱集作用，促进卵的孵化[38]。在本试验中，氮的添加降低了根系的生物量分配比，导致根系分泌物减少，从而抑制了卵的孵化。其次，氮肥中的尿素在土壤脲酶作用下可水解产生不利于线虫存活的氨[39]，增加总酚、类黄酮和可溶性糖等与植物抗病性相关物质的分泌，有助于植物抗病[40-42]。

然而，氮肥的施用量必须保持在合理水平，氮肥水平过高或过低均不利于植株的正常生长和抗病性增强。缺氮会明显降低有效穗数和株高[43]，但氮水平过高会降低植株的碳氮比，减少植物内萜烯和酚类等抗性物质的含量，从而降低植株的抗性[44]。在小麦与玉米周年生产的研究发现，每季氮肥施用量均为150 kg/hm2时可以获得最高周年产量，再增加肥料施用量，则产量不会增加[45]。随着冬小麦控释尿素施用量增加，氮肥偏生产力呈下降趋势[46]。杨卫星等[47]研究表明，适量施用尿素对禾谷孢囊线虫(Herteroderaavenae)的发生具有抑制作用且增产效果显著。黄菁华[48]发现，施用有机肥可以减少水稻潜根线虫(Hirschmaniellaoryzae)的发生；常海娜[49]发现，氮肥减量施用可以减轻连作番茄的根结线虫危害。张平珍等[50]研究发现，一定范围内银燕6号籽粒产量随尿素施用量的增加而提高，超过此范围反而降低。由此可见，氮肥施用量与作物产量呈抛物线关系，寻找最适施肥浓度可以降低成本，取得最大收益。

氮肥对作物抗病性因病原类型不同而有一定差异，并且受气候、土壤和作物品种等因素影响。缺氮会提高番茄对灰霉病的敏感性，但会提高对丁香假单胞菌的抗性[51]。高温高湿气候条件下增施氮肥反而会加重油菜菌核病的发病率[52]。在加拿大的曼尼托巴，线虫在黏土中随着氮素的增加而减少，而在沙质土壤中线虫数量却随着氮素的增加而增加[53]。不同肥料的组合也有不同影响，在非洲加纳，施用氮肥、磷肥或磷肥、钾肥的黑豆荚地块的病害高于未施肥地块，但施用氮肥、钾肥地块的病害感染率低于未施肥地块[54-55]。前人研究表明，寄主植物根系所分泌的高浓度木犀草素和槲皮素对根结线虫具有抗性，分泌的激素玉米素对线虫幼虫具有吸引力[56]。将番茄的ERF-E2基因敲除后，根系分泌物对南方根结线虫的吸引力显著增强，证明该基因可能在植物抗线虫机制中起重要作用[57]。因此，进一步研究植物根系分泌物的成分，有针对性地科学施用肥料，集成和提升作物高产、高效、优质和环保的养分资源管理技术体系，对于有效控制大豆孢囊线虫为害、促进农业农村绿色发展具有重要意义。