家猫卵母细胞与胚胎的冷冻保存及胚胎移植研究进展

罗渝雯，李俊，颛清芮，孟琳，杜幸柱，周丹，王龙飞，刘鸿宇，侯云鹏，傅祥伟,4*

（1.中国农业大学动物科学技术学院，北京 100193；2.河北医科大学第一医院生殖中心，河北石家庄 050031；3.中国农业大学生物学院，北京 100193；4.省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室，新疆石河子 832003）

2016 年，野生猫科动物被列入世界自然保护联盟濒危物种红色名录（IUCN）。家猫是与野生猫科动物亲缘关系最近且最容易获得的生物模型，已有研究证明多种家猫辅助生殖技术（ART）方案可以应用于野生猫科动物。同时，作为人类的伴侣动物，家猫的辅助生殖技术也获得了极大的社会关注度。

慢速冷冻和玻璃化冷冻是动物配子、胚胎冷冻保存的2 种基本方法。Whittingham 等于1972 年首次将小鼠胚胎成功进行低温保存，又于1977 年成功冷冻小鼠成熟卵母细胞。随后，低温保存技术不断在兔、牛、人等物种上成功应用。慢速冷冻过程中会遇到设备操作复杂、耗时长等诸多问题，特别是在慢速冷冻过程中，细胞内会不可避免地产生冰晶，损害细胞结构，严重时甚至会造成细胞死亡。为改善冷冻保存的效果，Rall 等在1985 年发明了玻璃化冷冻法。玻璃化冷冻利用高浓度的冷冻保护剂（CPA）处理细胞，实现快速降温从而使细胞呈现玻璃化状态。由于超快速降温和高浓度CPA 能抑制冷冻过程中冰晶的形成，因此玻璃化冷冻相对于慢速冷冻可以有效减少冷冻损伤。在过去的十年中，玻璃化冷冻已经逐步取代了慢速冷冻，成为冷冻保存卵母细胞的首选技术。但是玻璃化冷冻过程中高浓度的CPA 可能会引起蛋白质变性和亚细胞结构改变，继而影响胚胎的发育能力，因此现阶段的研究主要集中在降低CPA 的毒性以及缩短卵母细胞/ 胚胎暴露在CPA 中的时间。本文概述了国内外家猫配子与胚胎的冷冻保存以及胚胎移植的研究进展，以期为后续的研究提供参考。

1 家猫卵母细胞的冷冻保存

家猫卵母细胞冷冻耐受性较差，高脂质含量是造成冷冻损伤的重要原因。在正常生理条件下，脂肪物质为卵母细胞和胚胎提供了发育所必须的能量与物质基础。因此，脂质含量也是影响卵母细胞质量和抗冻性的重要参数。卵母细胞脂质在冷冻中发生的物理变化是造成冷冻损伤的主要原因，高脂肪含量的卵母细胞和着床前胚胎的冷冻保存是目前冷冻保存技术中亟待克服的一大难点。研究发现玻璃化冷冻前，使胞内脂质极化可显著提高家猫卵母细胞解冻存活率及囊胚发育率。

冷冻-解冻造成的线粒体功能障碍使卵母细胞发育能力下降。Sowińska 等研究发现冷冻-解冻后，猫卵母细胞线粒体分布异常，表现出线粒体的周边型分布——线粒体在体外成熟后并不分散在整个细胞内，而是靠近卵母细胞膜分布。这种冷冻后线粒体聚集的状态，可能也是猫玻璃化冷冻卵母细胞发育能力下降的原因。研究发现ROCK1 抑制剂可能通过改善线粒体及细胞骨架运动，促进猫玻璃化冷冻卵母细胞胞质成熟，提高受精率。

尽管家猫卵母细胞冷冻保存面临着上述问题，但解冻后部分存活卵母细胞受精仍能发育至囊胚，胚胎移植后有成活后代。目前，未成熟卵母细胞及成熟卵母细胞均已应用于家猫的冷冻保存，现就其冷冻损伤机理及冷冻方法概述如下。

1.1 未成熟卵母细胞冷冻保存

1.1.1 未成熟卵母细胞冷冻损伤机理 未成熟卵母细胞指处于生发泡期（GV 期）的卵母细胞。相对于成熟卵母细胞（MII 期），这一阶段不存在纺锤体，对渗透压有较强的耐受性。因此有学者认为GV 期卵母细胞对冷冻损伤更具抵抗力，可为辅助生殖技术和实验研究扩展卵母细胞来源。GV 期卵母细胞包含一个大型生发泡，由于其中染色质浓缩等因素，冷冻后会造成细胞损伤及影响表观遗传，这已成为制约其应用潜力的关键瓶颈。除此以外，对GV 期的卵母细胞进行冷冻保存时也可能会损伤细胞膜或卵丘细胞，这些细胞与结构直接影响卵母细胞的成熟过程。GV 期卵母细胞周围存在的卵丘颗粒细胞可能会改变脱水的速度和程度，进而可能加剧细胞质损伤的程度。在对其他物种（牛、羊）进行研究时发现，卵丘卵母细胞复合体（COCs）在玻璃化冷冻后体外成熟（IVM）培养 24 h，卵母细胞的核成熟率显著降低，细胞骨架损伤可能是导致这一现象的原因。同样，研究发现在家猫COCs 进行玻璃化冷冻前，去除卵丘细胞并在细胞骨架稳定剂中预培养，可以提高猫GV 期卵母细胞的核成熟率。

1.1.2 未成熟卵母细胞冷冻方法 与大多数家畜相同，最初用于家猫GV 期卵母细胞冷冻的是慢速冷冻法，但解冻后进行体外受精（IVF）未获得囊胚。之后，Cocchia 等第一次用开放式拉长细管（OPS）对猫GV 期卵母细胞进行玻璃化冷冻，并在IVF 后首次获得囊胚；但是，玻璃化冷冻卵母细胞获得的胚胎，其卵裂率和囊胚率均显著低于新鲜卵母细胞（卵裂率：18.6%vs.48.2%，囊胚率：18% vs.33.3%）。相比Cocchia等的方法，Tharasanit 等用OPS 通过四步法进行玻璃化冷冻可提高卵裂率和囊胚率，同时四步法相比两步法也可提高成熟率（37.6% vs.20%）。Snoeck 等发现在使用OPS 法冷冻未成熟卵母细胞时加入连接蛋白靶向多肽（GPA26）抑制连接蛋白37（Cx37）和连接蛋白43（Cx43）通道能提高孤雌激活（PA）胚胎的后续发育能力。此外，Colombo 等用冷冻条（Cryotop）保存猫GV 期卵母细胞，发现冷冻可能会引起DNA 损伤和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）激活，用泛caspase 抑制剂降低caspase 酶活性后，可将冷冻后卵母细胞的成熟率提高至接近于新鲜卵母细胞，且不影响胚胎后续发育。实际应用中，大部分野生猫科动物的卵巢是在野外死亡的动物身上获得的，无法及时将卵巢运送至实验室。有研究为了验证低温保存运输对卵母细胞质量的影响，分别从低温保存运输了24 h 的卵巢组织及新鲜卵巢组织中获取GV 期卵母细胞，用Cryotop 冷冻、解冻后继续培养，发现两组卵母细胞成熟率相同（41%），且卵母细胞减数分裂进程没有差异。这些数据表明低温保存卵巢、延迟玻璃化冷冻并没有破坏减数分裂恢复机制。受精后，卵巢冷藏后获得的卵母细胞卵裂率显著降低，但后续胚胎发育未见差异，证实卵巢冷藏保存24 h 是有效保存猫卵母细胞并维持较高存活率的方法。

1.2 成熟卵母细胞冷冻保存

1.2.1 成熟卵母细胞在冷冻保存中的应用及冷冻损伤在猫科动物中，由于伦理问题以及个体的特殊性，通常只在稀有个体意外死亡后才能获取配子，因此超低温保存策略主要集中在未成熟卵母细胞上，对MII 期卵母细胞的研究相对较少。相比于冷冻GV 期卵母细胞，在MII 期进行冷冻保存的优点是：卵母细胞在暴露于低温之前已经完成核成熟，这是卵母细胞受精前发育的关键环节。但是对MII 期卵母细胞进行超低温保存会引起染色体排列异常、基因表达异常以及活性氧增加、DNA 碎片化比例升高等现象。也有研究认为玻璃化冷冻前的减数分裂状态（未成熟与体外成熟）并不影响受精率和桑葚胚率，但尚需更多研究证实。

1.2.2 成熟卵母细胞冷冻方法 Luvoni 等最早用慢速冷冻法分别冷冻了成熟卵母细胞和未成熟卵母细胞，发现成熟卵母细胞冷冻后的发育能力更好。2004 年，Murakami 等第1 次对猫MII 期卵母细胞进行玻璃化冷冻，将体外成熟的猫MII 卵母细胞用细管（Straw）进行玻璃化冷冻，解冻后存活率可达48.7%，进行IVF后首次获得囊胚（囊胚率3.7%）。Merlo 等进一步改善玻璃化冷冻保存方法，首次使用了冷冻环（Cryoloop）法冷冻成熟卵母细胞。Cryoloop 法能使胚胎与液氮直接接触，且所用冷冻液体积小于1 μL，因而在冷却过程中具有降温速度快和降温统一均衡的优点，相比于Straw 法获得了更高的囊胚率（11.8%），并首次获得了孵化囊胚。最近有报道称，运用Gandhi 等人发明的冷冻器（Cryoteach）法对猫体外成熟的MII 期卵母细胞进行玻璃化冷冻，解冻后具有较高的存活率和发育能力（冷冻存活率>60%，PA 后卵裂率达22%），但未获得囊胚。冷冻过程中，可以通过改进冷冻载体提高冷冻-解冻速度，缩短与CPA 的接触时间，从而降低CPA 造成的化学毒性损伤，提高冷冻存活率。此外，也有研究通过调整CPA 的成分来减少对细胞的毒性损伤，进而提高冷冻保存后的发育能力，例如在冷冻液中添加非渗透性CPA——聚蔗糖 PM-70（Ficoll PM-70）能显著提高猫MII 期卵母细胞玻璃化冷冻后的存活率。由于猫卵母细胞内含有大量的脂质会降低其抗冻性，有研究发现去除MII 期脂质可提高冷冻后的存活率和受精后的体外发育能力。

2 猫胚胎的冷冻保存

相比于配子的冷冻保存，胚胎冷冻保存可以保存父母双方的全部遗传物质，是辅助生殖技术的重要组成部分。在胚胎冷冻保存过程中，虽然有些细胞受损或死亡，但剩余的存活细胞足以维持胚胎的正常发育。到目前为止，大约有40 个物种（包括人类和实验动物）的胚胎冷冻保存获得了成功。自1988 年Dresser 等用慢速冷冻首次成功保存了家猫体内发育的桑葚胚和囊胚以来，胚胎冷冻技术应用日渐成熟，家猫作为最受欢迎的伴侣动物之一，对家猫胚胎进行冷冻保存的需求也与日俱增。由于不同阶段胚胎体积、组成、相变温度、相关结构等各不相同，胚胎在冷冻保存过程中的冷冻耐受性也不同。针对各个阶段的特性，将早期胚胎以囊胚为分界线，分别简要阐述。

2.1 早期胚胎的冷冻保存

2.1.1 冷冻保存方法 冷冻保存后能否恢复卵裂是早期胚胎冷冻保存成功与否的主要决定因素。不同冷冻保存方法的结果各有优劣，但对于大多数富含脂质的哺乳动物胚胎来说，玻璃化冷冻比慢速冷冻效果更好。Pope 等同时使用慢速冷冻法和Cryotop 法冷冻了2-细胞胚胎，解冻后存活率分别为22% 和6%，两组冷冻胚的囊胚发育相似（22～26%），移植给受体后均产下后代，但囊胚发育率均低于新鲜胚（50%）。因此，普遍认为玻璃化冷冻和慢速冷冻后的家猫2-细胞胚胎体外发育潜力相似。2020 年的一项研究分别用慢速冷冻法和玻璃化冷冻法冷冻4～8 细胞期胚胎，2 组存活率（78.2% vs.85.2%）和囊胚率（20% vs.28.6%）均无统计学差异，与之前的研究结果一致。

表1 家猫卵母细胞不同阶段冷冻保存

2.1.2 不同发育阶段的早期胚胎冷冻耐受性差异 除冷冻保存方法外，胚胎发育阶段的选择也被认为是影响冷冻-解冻胚胎存活的关键因素。Ochota 等利用Cryotop 法冷冻了不同阶段的早期胚胎（2 细胞、4～8细胞、>8 细胞以及桑葚胚），发现不同发育阶段的猫早期胚胎玻璃化冷冻后的存活率没有差异（76.9%、73.3%、93.3%、72.7%），但在解冻后的发育过程中，仅4～8 细胞和>8 细胞的胚胎能发育到囊胚（13.3%、26.7%）。

2.2 囊胚冷冻保存 囊胚是多细胞结构，体积较大、内含大量的囊胚腔液，相对于其他阶段的胚胎，冷冻保存难度更大。Tsujioka 等以家猫IVF 胚胎作为研究对象，采用Cryotop 对6 d（n=42）或7 d（n=27）囊胚进行玻璃化冷冻保存，首次获得了玻璃化冷冻后存活的囊胚（73.8%、66.7%），并发现较早达到囊胚（6 d囊胚）阶段的体外受精胚胎存活率更高。此外，慢速冷冻法亦用于猫囊胚和扩张囊胚的冷冻保存，报道指出解冻后囊胚的存活率低于扩张囊胚（30% vs.34%）。为了提高囊胚冷冻-解冻后存活率，Ochota 等用人工皱缩法减少了扩张囊胚腔液，可使存活率显著提高（64.3% vs.38.5%）。除改造囊胚本身的生物学特性外，后续研究还不断尝试新的冷冻方法以及调整CPA 组成。最近有研究发现采用Cryotop 多步法进行玻璃化冷冻，能显著提高存活率（100%）。

3 猫的胚胎移植

1979 年，Kraemer 等报道了第一例成功的猫胚胎移植（ET）。1988 年Goodrowe 等首次将IVF 胚胎移植给受体母猫后产下小猫。目前，家猫的胚胎移植在多个实验室获得了成功，研究发现家猫早期囊胚前任一阶段的胚胎均能进行胚胎移植，不同方式获得的胚胎，如体内或体外成熟的卵母细胞IVF、卵胞浆内单精子注射（ICSI）、体细胞核移植（SCNT）以及冷冻保存胚胎等经移植均能正常产仔。根据移植部位不同可分为子宫移植及输卵管移植。

3.1 子宫移植 由于家猫的胚胎能在子宫中迁移，可在两侧子宫角中均匀分配，因此家猫的胚胎移植只需进行单侧移植。将IVF、ICSI、SCNT 和冷冻的胚胎移植到受体子宫角后均有后代出生，但胚胎存活率不高。然而，大多数早期的胚胎移植需要剖腹手术才能进入子宫，对受体伤害较大。Veraguas 等用eCG 诱导家猫排卵，进行IVF 后将胚胎移植，移植了9 枚5 d（桑葚胚或早期囊胚）胚胎，20 d 后检测到2 个孕囊，但最终只产下一只小猫；后移植15 枚7 d（9 个囊胚，6个孵化囊胚）胚胎后产下一只小猫。在体外培养过程中，会有一部分胚胎在D8 孵化，失去透明带，但是体内胚胎在D13 早期附植前均能观察到透明带，综合部分桑葚胚和/或囊胚移植结果，可以推测完整的透明带在猫胚胎的成功着床和随后发育中起着重要作用，但需要进一步验证。

3.2 输卵管移植 猫胚胎体外生产效率与其他物种相似，但移植到受体体内后，胚胎体内发育潜力严重降低，包括妊娠率低于正常水平、胚胎移植后存活率低且窝产仔数较少等。研究发现借助腹腔镜技术将早期卵裂（2～4 个细胞）胚胎直接移植到输卵管中，缩短体外培养时间（限制在24～30 h），减少体外环境的负面影响，可克服猫科动物胚胎移植后发育潜力减弱等一系列问题。腹腔镜输卵管移植可用于各种来源的胚胎移植。在人工繁育过程中，为了获得期望的后代，常使用性控冻精。Pope 等使用X-性控冻精与体内成熟卵母细胞实施IVF，将2 d 胚胎（9～16 枚/只）通过腹腔镜移植到同期发情的受体母猫输卵管中，出生率可达到70%（7/10）。2012 年，Pope 等采用ICSI 技术将来源于体外成熟卵母细胞的早期胚胎用腹腔镜移植到两只受体输卵管中，获得4 只小猫。同年，Pope 也分别将冷冻（慢速冷冻和玻璃化冷冻）后的胚胎用腹腔镜移植到猫的输卵管中，都产下了小猫。

4 总结

配子和胚胎的冷冻保存结合胚胎移植技术是维持哺乳动物物种遗传多样性的有效方法，对于种质资源的保存、濒危物种保护等具有重大意义。在过去的几十年里，家猫辅助生殖技术取得了巨大进步，特别是在配子和胚胎的冷冻保存和胚胎移植方面。尽管取得了较大进展，但还没有公认的最优方案应用到实践中，大多数方法依然是处于实验阶段，无法大规模投入使用。最重要的是，目前对冷冻机理的研究还不够透彻，不同冷冻保存过程中使用的方法各不相同，且冷冻保存方法过于局限，没有足够的实验结果来支撑结论，未来还需要进一步的研究以简化、优化冷冻保存方法，为珍稀猫科动物配子与胚胎的有效保存奠定基础。