HPLC测定苏黄止咳胶囊中紫苏醛含量的不确定度评定
2022-09-13丰杰
丰杰
苏黄止咳胶囊源于中日友好医院中医呼吸科主任医师晁恩祥教授四十余年对呼吸疾病的临床实践积累和研究成果，晁教授认为“咳嗽变异性哮喘”符合中医“风性善行数变”的特点，属于“风咳”的范畴，确定了疏风宣肺、解痉止咳的主要治法。苏黄止咳胶囊处方由麻黄、紫苏叶、地龙、蝉蜕等9味中药材组成，用于风邪犯肺，肺气失宣所致的咳嗽等。用于感冒后咳嗽和咳嗽变异性哮喘（cough variant asthma，CVA）的治疗。处方中，麻黄和紫苏叶为君药，麻黄用于发汗散寒，宣肺平喘，利水消肿；紫苏叶用于解表散寒，行气和胃。因此，检测、评价苏黄止咳胶囊中紫苏醛的含量，对物质用量与临床疗效研究，具有重要意义。参考《测量不确定度评定与表示》及相关技术规范[1-3]内容，对苏黄止咳胶囊中紫苏醛的含量测定结果进行测量不确定度评价。通过识别、计算紫苏醛含量测定过程中的各不确定度影响因素，分析不确定度分量对紫苏醛含量检测结果的影响，为客观评价紫苏醛含量测定结果提供了分析数据。通过分析不确定分量的占比，针对性的采取预防或改进措施，提高检验结果的准确度，减少检测引入的不确定度值[4-6]。
1 实验准备
高效液相色谱仪（厂家：安捷伦，产地：美国，型号Agilent 1100），梅特勒-托利多XS205电子天平，上海能信SB3200T超声波清洗仪，超纯水仪；紫苏醛对照品（购自中国食品药品检定研究院，批号111806-201303，纯度为95.1%）。苏黄止咳胶囊，国药准字Z20103075，规格：0.45 g，由生产厂家扬子江药业集团北京海燕药业有限公司提供。色谱纯甲醇，超纯水，其它试剂为分析纯。
2 实验内容
2.1 实验色谱条件
岛津色谱柱：Shim-pack VP-ODS C18（ 4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（68∶32）；流速0.8 mL/min；检测波长230 nm；柱温30℃；进样量10 μL。
2.2 实验方法
2.2.1 制备对照品溶液 精密称量紫苏醛对照品149.1 mg，置于50 mL棕色容量瓶，加甲醇溶解、摇匀，稀释定容至50 mL， 配成2.836 g/L的紫苏醛对照品溶液。精密量取此对照品溶液 1 mL置50 mL 量瓶中，加甲醇溶解、摇匀、稀释至刻度，得56. 72 mg/L的紫苏醛对照品溶液。
2.2.2 制备供试品溶液 精密称定苏黄止咳胶囊内容物5 g，放入内有数粒玻璃珠的圆底磨口烧瓶内（500 mL），加入150 mL蒸馏水后，安装挥发油提取器，并从提取器上端加水至溢流入烧瓶为止，再加入乙酸乙酯1.0 mL，连接回流冷凝器，加热至沸，并保持微沸4 h。待圆底烧瓶及挥发油提取器放冷至室温后，取乙酸乙酯层，加入色谱甲醇定容至5 mL，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
3 评定不确定度
按照测量不确定度评定的步骤，从测量操作的人员、测量所使用的仪器/器皿、测量使用的方法、测量所处的环境等方面全面考虑，分析紫苏醛含量测定过程的不确定度来源[7-9]。
3.1 建立测量模型
供试品中紫苏醛含量的计算公式是[10-11]：
上式中，X为紫苏醛的含量（mg/g）；C对是紫苏醛对照品溶液的浓度（mg/L）；A供为供试品溶液中紫苏醛的色谱峰峰面积；V供为供试品溶液的体积（mL）；m供是苏黄止咳胶囊称样量（g）；A对是对照品溶液中紫苏醛的色谱峰峰面积。其中，m对为紫苏醛对照品称样量（mg）；V50、V1为紫苏醛对照品配置所需溶剂的体积（mL）。
3.2 评定分析不确定度分量
3.2.1 紫苏醛对照品溶液引入的不确定度 紫苏醛对照品溶液引入的不确定度来自紫苏醛溶液的配置和检测。紫苏醛溶液配置的不确定度，来自紫苏醛质量引入的不确定度、稀释溶解过程引入的不确定度。而紫苏醛质量的不确定度来源于其纯度和称样量[12-14]。
3.2.1.1 紫苏醛纯度引入的不确定度 紫苏醛对照品纯度为95.1 %，使用说明书无不确定度信息，故不考虑纯度引入的不确定度，即紫苏醛纯度的相对标准不确定度urel（P对）=0。
3.2.1.2 紫苏醛称重引入的不确定度 天平重复称重引入的不确定度：称量紫苏醛的电子天平，其检定证书提供重复性误差为±0.05 mg，按均匀分布计算其标准不确定度是：
天平的示值允许误差引入的不确定度：称量紫苏醛的电子天平的最大允差为±0.1 mg（d=0.01 mg），按均匀分布计算其标准不确定度是：
由于紫苏醛采用减重法称量，即两次称量值之差，每次称量均受随机影响和天平校准的影响。故减重称量过程引入的不确定度：
因而对照品紫苏醛称量的相对标准不确定度分别是：
3.2.1.3 紫苏醛溶液配制引入的不确定度 紫苏醛溶液配置过程中引入的不确定度，主要从配置容器校准引入，以及溶液配置时、配置容器和溶液的温度与配置容器体积校准时的温度差异引入[15-16]。该配置过程涉及容器主要由移液管、容量瓶。
其中，配置容器校准引入的不确定度：紫苏醛溶液配制过程中，使用了1 mL定量移液管、5 mL容量瓶、50 mL容量瓶，其校准证书中允许误差分别为±0.007 mL、±0.015 mL与±0.1 mL。按三角分布计算，以上玻璃仪器校准的相对不确定度则分别是：
紫苏醛溶液配置时，配置容器和溶液的温度与配置容器体积校准时的温度存在差异引入的不确定度：紫苏醛溶液和配置容器的温度为25℃，与配置容器校正时的温度（20 ℃）有 ±5 ℃的温差，水的膨胀系数是2.1×10-4mL/℃，按矩形分布计算，配置温差导致的相对不确定度是：
因而，制备对照品溶液不同稀释体积引起的相对不确定度是：
故制备对照品溶液引入的相对不确定度是：
制备供试品溶液而引起的相对不确定度是：
3.2.1.4 紫苏醛色谱峰检测引入的不确定度 紫苏醛色谱峰检测引入的不确定度，主要由紫苏醛溶液重复进样引起的，对照品溶液连续进样6针重复测量的峰面积分别是：974.4、969.9、967.7、964.7、962.7、963.7，平 均 值 为967.18，其峰面积测量的标准不确定度按照贝塞尔公式计算，得：
那么，由紫苏醛溶液色谱峰检测（峰面积）引入的相对不确定度是：
综上，紫苏醛溶液引入的相对不确定度是：
3.2.2 供试品溶液含量测定的不确定度评估 与3.2.1项相同，供试品溶液中紫苏醛含量测定的不确定度，来自于供试品的溶液浓度和色谱峰检测等。供试品的溶液浓度引入的不确定度，主要是苏黄止咳胶囊称重和配制过程稀释体积引入的不确定度。供试品溶液色谱检测引入的不确定度来自于仪器。
3.2.2.1 苏黄止咳胶囊称重引入的不确定度 天平重复称重引入的不确定度：称量供试品的电子天平（d=0.1 mg），校准证书显示重复性误差是±0.1 mg，按均匀分布计算其标准不确定度为：
同时，天平的最大允差为±1.0 mg（d=0.1 mg），按均匀分布计算其标准不确定度为：
根据实际称量过程，还应该考虑减重法称量过程引入的不确定度，一次称量所引入的不确定度为：
由于试验平行称取两份供试品，重量分别为5.048 6 g、5.104 3 g，每份供试品称重的相对标准不确定度是：
故，供试品称重引入的相对标准不确定度是：
3.2.2.2 供试品配制过程稀释体积引起的相对不确定度 供试品溶液制备引起的相对标准不确定度，即：
3.2.2.3 供试品的色谱峰峰面积引起的相对不确定度 供试品的色谱峰峰面积是采取双样平行法测定的，其中，供试品溶液1的色谱峰峰面积是934，930.6，平均峰面积为932.3，两者差值R1=3.4；供试品溶液2的色谱峰峰面积是973.2，968.2，平均峰面积为970.7，差值R2=5。按照极差法计算，n=2时，极差系数C=1.13。故：
则苏黄止咳胶囊溶液的峰面积引入的相对不确定度为：
综上，苏黄止咳胶囊供试品溶液相对不确定度：
3.3 计算合成不确定度
检测苏黄止咳胶囊中紫苏醛含量结果的合成不确定度是：
3.4 计算扩展不确定度
检测苏黄止咳胶囊中紫苏醛含量的结果符合正态分布，置信概率为95%，包含因子k为2，本实验的相对扩展不确定度是：
3.5 报告测量不确定度
检测苏黄止咳胶囊中紫苏醛含量的结果，表示为X=（16.6±0.188）μg/g。在含量测定过程中，各类来源的不确定度对总不确定度的贡献具体如表1所示。数据显示，供试品的称样量、供试品中紫苏醛的峰面积是导致苏黄止咳胶囊中紫苏醛含量测定分析中不确定度的最大影响因素。
表1 不确定度分量来源及占比
4 分析与讨论
通过对苏黄止咳胶囊中紫苏醛含量进行不确定度分析评价，计算出检测苏黄止咳胶囊中紫苏醛含量结果的扩展不确定度是0.188 μg/g，紫苏醛的含量结果是（16.6±0.188）μg/g。不确定度评价结果提示，峰面积、稀释体积对苏黄止咳胶囊中紫苏醛含量测定的不确定度的影响相对较大，特别是供试品中紫苏醛的峰面积、对照品的配制稀释倍数，是检测苏黄止咳胶囊中紫苏醛含量的分析过程中最大的影响因素。对于供试品检测引入的不确定度，可以对高效液相进行定期计量及期间核查，日常开展维护保养，提高仪器检测的准确性和灵敏度，减少测量设备引入的不确定度。同时，适当增大供试品的称样量及进样体积，增加供试品峰面积，减少样品本身可能引入的不确定度。针对对照品稀释倍数引入的不确定度分量，适当减少对照品的称样量及减少稀释步骤，减少不确定度引入的比重。
此次评定可用于苏黄止咳胶囊中紫苏醛含量检测结果的质量评价。在日常检验中，明确操作细节和日常的管理要求，尽可能减少随机效应引入的测量不确定度[17-19]。此外，在实验室认可时，实验室的测量能力也是通过测量范围及在该测量范围内相应的测量不确定度表述的，也就是说测量不确定度评定在药物分析中有着重要作用。
