高效液相色谱法同时测定华北獐牙菜中5种有效成分的含量

刘学良，刘安平，李维业，石春兰，问静，王永晶，祁彦凯，王开祥，陈鹏，韩达斌，刘海青*（.青海省药品审评核查中心，西宁 80007；.西宁市食品药品检验检测中心，西宁 80007）

华北獐牙菜别称“乌氏当药”，在《中国植物志》[1]、《中国高等植物图鉴》[2]、《藏药志》[3]均有记载，为龙胆科植物獐牙菜属华北獐牙菜Swertia wolfangianaGrun.的干燥花[4]。华北獐牙菜藏语名“代哇”，藏医将其作为治疗肝胆类疾病的藏药材“桑蒂”的来源之一，通常在7～8月采其花，以纸遮蔽，晒干后使用，味苦、性寒，具有清热利胆之功效，也用于治疗流行性感冒[3-4]。华北獐牙菜生于海拔1500～5260 m的河谷阶地、高山草甸、沼泽草甸、灌丛中及潮湿地，在西藏东部、四川、青海、甘肃南部、山西、湖北西部均有分布[5-6]。

目前，关于华北獐牙菜研究方面的研究文献较少，主要集中在药材资源整理、调查等方面[7-12]，未查到其有效成分分离鉴定、质量控制等方面的文献。本研究首次采用高效液相色谱法测定獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素5种有效成分的含量，方法操作简便、有效，可为今后进一步研究华北獐牙菜提供依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

Waters 2695型高效液相色谱仪，紫外检测器（2489），Waters 2695型Empower 化学工作站（美国Waters 公司）；十万分之一电子天平（METTLER TOLEDO），紫外可见分光光度计（PE Lambda 35，PE 公司）。

1.2 试药

对照品獐牙菜苦苷（批号：110785-201404，纯度：98.3%），龙胆苦苷（批号：110770-201918，纯度：97.1%），当药苷（批号：111742-200501，纯度：99.2%），芒果苷（批号：111607-200704，纯度：98.1%），异荭草素（批号：111974-200401，纯度：94%）（中国食品药品检定研究院）。甲醇为色谱纯，磷酸为优级纯，其余试剂为分析纯；水为超纯水。华北獐牙菜药材均由项目组人员分别从青海玉树市、同德县、同仁县采集，经青海省药品审评核查中心刘海青主任药师鉴定。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验[13-17]

Waters SunFire C18柱（4.6 mm×250 mm，5µm），甲醇（A）-0.05%磷酸溶液（B）为流动相，进行梯度洗脱（0～5 min，10%～25%A；5～11 min，25%～45%A；11～25 min，45%～70%A；25～35 min，70%～80%A）；流速1.0 mL·min－1；检测波长为254 nm；柱温30℃；进样量10 µL。在此色谱条件下，獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素与样品中其他成分分离度均大于1.5，理论板数龙胆苦苷峰计算不低于3000，见图1。

图1 华北獐牙菜HPLC色谱图Fig 1 HPLC chromatograms of Swertia wolfangiana Grun.

2.2 对照品溶液的制备

精密称取对照品獐牙菜苦苷9.72 mg、龙胆苦苷9.03 mg、当药苷8.78 mg、芒果苷7.11 mg、异荭草素8.28 mg，分别置25、10、25、10、25 mL量瓶中，加甲醇超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。依次精密量取上述对照品储备液3、6、8、2、4 mL置25 mL量瓶中，加甲醇超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，即得獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素对照品质量浓度分别为0.0459、0.2104、0.1116、0.0558、0.0498 mg·mL－1的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取本品粉末（过三号筛）约0.2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称定重量，超声处理30 min（功率250 W，频率50 kHz），取出，放至室温，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 线性关系考察

精密称取獐牙菜苦苷对照品5.56 mg、龙胆苦苷对照品19.67 mg、当药苷对照品10.98 mg、芒果苷对照品5.96 mg、异荭草素对照品5.62 mg，置50 mL量瓶中，加甲醇超声使溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品混合溶液。精密量取上述对照品混合溶液0.5、1、2.5、5、7.5 mL，分别置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，取上述溶液及对照品混合溶液分别注入液相色谱仪，测得峰面积。以对照品峰面积（Y）对数值为纵坐标，进样量（X）为横坐标，用外标两点法计算并绘制标准曲线，得回归方程分别为Y獐牙菜苦苷＝9.409×105X＋1.760×103（r＝0.9993）、Y龙胆苦苷＝1.380×106X－4.007×103（r＝0.9996）、Y当药苷＝2.751×105X＋3.399×103（r＝0.9995）、Y芒果苷＝3.830×106X－2.903×104（r＝0.9999）、Y异荭草素＝2.440×106X－3.947×103（r＝0.9992）。进样量分别在0.0546～1.0930 µg、0.1910～3.8200 µg、0.1089～2.1780 µg、0.0584～1.1690 µg、0.0528～1.0570 µg与峰面积线性关系良好。

2.5 精密度试验

精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液，连续进样6次，记录峰面积，结果獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素峰面积RSD分别为0.74%、0.61%、0.77%、0.85%、0.62%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取同一供试品溶液（编号：HBZYC01），分别于0、2、4、8、16、24 h进样测定，记录峰面积，结果獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素峰面积RSD分别为0.85%、0.64%、0.77%、1.1%、0.69%，结果表明供试品中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素在24 h内稳定性良好。

2.7 重复性试验

取华北獐牙菜样品（编号：HBZYC01）6份，按“2.3”项下方法制备，进样测定，结果獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素平均含量分别为0.21%、2.54%、1.41%、0.73%、0.85%，RSD分别为0.62%、0.77%、0.64%、0.84%、0.60%，表明该方法重复性良好。

2.8 加样回收试验

称取华北獐牙菜样品（编号：HBZYC01）6份，每份0.1 g，精密称定，置锥形瓶中，在每组中分别加入适量獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素对照品，按“2.3”项下方法制备，进样测定各成分的含量，计算回收率，结果獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素的平均回收率分别为97.62%、97.04%、97.68%、95.66%、96.75%，RSD分别为1.3%、0.79%、0.53%、0.79%、0.92%（n＝6），表明该方法的回收率良好。

2.9 样品含量测定

3批次华北獐牙菜药材粉末各取约0.2 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备，进样测定，计算各批次华北獐牙菜中各成分的含量。结果按干燥品算，3批次华北獐牙菜药材中獐牙菜苦苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草素含量分别在0.18%～0.24%、2.18%～2.99%、1.21%～1.55%、0.62%～0.81%、0.70%～0.91%，见表1。

表1 样品含量测定结果(n＝3，%)Tab 1 Content determination (n＝3，%)

3 讨论

3.1 检测波长的确定

通过对 5种化合物甲醇溶液进行全波长扫描，獐牙菜苷、龙胆苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草苷的最大吸收波长分别为250、275 nm，240 nm，255、350 nm，258、317 nm，270、348 nm。选择254 nm为检测波长时测定可兼顾5个成分最大吸收，且色谱图基线平稳，色谱峰峰形较好。故确定254 nm 作为本试验的检测波长。

3.2 提取方法和色谱条件的优化

通过对不同极性溶剂、提取方法、提取时间等因素进行考察，确定样品提取以甲醇为溶剂、超声处理效率最高，提取时间确定为30 min。分别对甲醇-0.05%磷酸溶液、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.1%磷酸溶液等流动相进行考察，从混合对照品和样品中被测成分的分离情况、基线的稳定性及分析时间等方面综合分析，最终选择以甲醇-0.05%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱较为合适。

3.3 结果分析

华北獐牙菜中5种被测成分中龙胆苦苷的含量最高，在3批次样品中的平均含量为2.57%，占5种被测成分质量分数总和的45.01%。獐牙菜苦苷、当药苷、芒果苷、异荭草苷分别占3.68%、24.34%、12.61%和14.36%。另外，试验过程中还尝试开展了华北獐牙菜中其他成分的含量测定试验，但由于含量较低、分离不好等原因，未进行定量检测。可见，华北獐牙菜中的环烯醚萜类及黄酮类化合物为其主要成分，而此类化合物的药理活性颇为丰富，龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、当药苷、芒果苷及异荭草素等化学成分，具有镇痛、保肝利胆、抗炎、抗菌、抗肿瘤、抗病毒、降糖、镇咳、祛痰、平喘、抗氧化等广泛药理活性[18-22]，能与该药材具有的清热利胆、治疗流行性感冒等功效相对应。

本研究建立了华北獐牙菜中5种有效成分的HPLC 测定方法，该方法简便、高效、准确，可用于华北獐牙菜的质量控制，为该药材的综合利用开发提供了参考依据。