UPLC-MS/MS法快速测定多效唑在麦冬中的残留及其对麦冬化学成分的影响

俞磊明，张娜，李琦，朱光明，黄维，王卫华，姜云耀*（.上海市药材有限公司，上海 0008；.清华大学药学院 中药研究院，北京 00084；.清华大学药学院 药物药学技术中心代谢平台，北京 00084）

中药麦冬为百合科沿阶草属植物麦冬

Ophiopogon japonicus

（

L.f

）Ker-Gawl.的 干 燥 块根，在《神农本草经》中被列为上品。麦冬味甘、微苦、性凉，有养阴生津、清心除烦的功效，且有抗血栓、抗衰老、降血糖、免疫调节、心肌保护等药理活性。近年来，麦冬市场需求不断扩大，为确保产量，麦冬栽培品中农药、植物生长调节剂的使用越来越频繁。据报道，四川栽培的麦冬（川麦冬）植物生长调节剂用量较大，过度使用植物生长调节剂影响麦冬的品质和安全性。多效唑是麦冬种植中广泛应用的三唑类植物生长延缓剂，对麦冬块根增产效果显著，目前已成为麦冬药材种植中普遍施用的生长激素。本研究建立了UPLCMS/MS法测定麦冬中多效唑残留情况，同时采用UPLC-QTOF-MS及紫外分光光度法对麦冬进行整体成分分析、总黄酮及总皂苷含量测定，探讨多效唑对麦冬化学成分的影响，以期为麦冬药材的质量控制及多效唑残留检测提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

超高效液相色谱仪（ACQUITY UPLC，美国沃特世公司）；三重四极杆质谱仪（Qtrap 4500，美国AB SCIEX公司）；分析天平（BSA224S，赛多利斯科学仪器有限公司）；超声波清洗器（SB25-12DTD，宁波新芝生物科技股份有限公司）；中草药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；离心机（美国赛默飞世尔科技公司）；超高效液相-串联四极杆飞行时间高分辨质谱仪（Waters Synapt G2 Si，美国沃特世公司）；UV-2600紫外分光光度计（岛津仪器苏州有限公司）。

1.2 试药

所有麦冬药材由上海市药材有限公司提供，经清华大学中药研究院特聘研究员陈军力鉴定为百合科沿阶草属植物麦冬

Ophiopogon japonicus

（

L.f

）Ker-Gawl.的干燥块根；多效唑对照品（纯度≥95%，批号：Q21M9F61825，上海源叶生物科技有限公司）；鲁斯可皂苷元（纯度≥98%，批号：111909-201906，中国食品药品检定研究院）；橙皮苷（纯度≥98%，批号：K09S11L123847，上海源叶生物科技有限公司）；甲醇、乙腈、甲酸、异丙醇（均为质谱纯，美国Thermo Fisher公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 UPLC-MS/MS快速测定麦冬中多效唑的残留

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取多效唑对照品适量，置25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，配制成1 µg·mL的多效唑对照品储备液，4℃冷藏待用。

2.1.2 供试品溶液的制备 精密称取麦冬药材粉末0.2 g，加1.5 mL异丙醇，超声提取30 min（功 率50 kHz，100 W），13 000 r·min离 心10 min，取上清液1 mL，浓缩至干，加入100 µL 50%的甲醇复溶，13 000 r·min离心10 min，取上清液，作为供试品溶液备用。

2.1.3 色谱和质谱条件 色谱柱：Waters Acquity UPLC BEH C色 谱 柱（50 mm×2.1 mm，1.7µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%的甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0～3 min：20%～100%A；3～5 min：100%A；5.1～ 8 min：20%A），流 速0.2 mL·min，柱温30℃，进样量10 µL。电喷雾正离子电离模式，多反应监测法测定，参数如下：气帘气（CUR）30 psi，离子源温度（TEM）500℃；锥孔电压（IS）5500 V；辅助气（GS1、GS2）50 psi。质谱采集参数见表1，色谱图见图1。

图1 多效唑对照品（A）和麦冬样品（B）的UPLC-MS/MS色谱图Fig 1 UPLC-MS/MS chromatograms of paclobutrazol（A）and Ophiopogonis Radix（B）

表1 目标化合物质谱检测离子和采集参数
Tab 1 Spectrum acquisition parameters for target compound

参数 值Q1 294.3 Q3 70.1 DP/V 120 CE/V 46 CXP/V 11

2.1.4 线性关系考察 精密吸取多效唑对照品储备液，用50%甲醇稀释成质量浓度为500、200、50、10、2、0.5、0.2 ng·mL的多效唑对照品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件测定。以多效唑对照品进样量（ng）为横坐标，定量离子对峰面积为纵坐标进行线性回归，得到多效唑的回归方程为

Y

＝87.02

X

＋5.354（

r

＝0.9973）。结果表明，多效唑在0.002～5 ng与峰面积呈良好的线性关系。2.1.5 精密度试验 精密吸取多效唑对照品溶液10 µL，按“2.1.3”项下色谱条件连续进样6次，记录对照品峰面积。结果多效唑峰面积的

RSD

值为0.80%，表明仪器精密度良好。2.1.6 稳定性试验 取11号麦冬药材样品，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液。分别于0、2、4、8、12、24 h按“2.1.3”项下色谱条件测定。结果显示，多效唑峰面积的

RSD

值为1.4%，表明供试品溶液在24 h内稳定。2.1.7 重复性试验 取11号麦冬药材样品，按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液。按“2.1.3”项下色谱条件测定，计算质量分数。结果显示，多效唑峰面积的

RSD

值为1.1%，表明该方法重复性良好。2.1.8 加样回收试验 取11号麦冬药材样品6份，每份约0.1 g，精密称定，分别加入相当于供试品中多效唑含量100%的对照品。按“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液，进样测定，并计算回收率和

RSD

值。结果多效唑平均回收率为98.0%，

RSD

值为1.8%，表明该方法的加样回收率良好。

2.1.9 样品含量测定 取16批麦冬药材样品，按“2.1.2”项下方法制备成供试品溶液，按“2.1.3”项下色谱条件测定，计算各样品中多效唑的含量。结果见表2，在四川栽培的麦冬药材样品中全部检测到多效唑的残留，而在湖南和上海的野生麦冬样品中均未检测到多效唑的残留。

表2 麦冬样品中多效唑残留情况
Tab 2 Content of paclobutrazol in Ophiopogonis Radix

样品编号 产地 多效唑含量/（mg·kg－1）1234567891 0 11 12 13 14 15 16四川绵阳三台县四川绵阳三台县四川绵阳三台县四川绵阳三台县四川绵阳四川绵阳四川绵阳四川绵阳四川绵阳四川（万仕城1号）四川（万仕城2号）四川（代代为本特级）四川（代代为本一级）四川（代代为本一级）湖南（野生）上海（野生）0.006 0.012 0.013 0.015 0.015 0.015 0.049 0.016 0.019 0.007 0.027 0.005 0.002 0.014未检出未检出

2.2 多效唑对麦冬整体化学成分的影响研究

2.2.1 供试品溶液的制备 采用UPLC-QTOFMS植物代谢组学法初步研究多效唑施用与否对麦冬整体化学成分的影响，麦冬样品信息见表3。取麦冬药材样品粉末0.2 g于15 mL离心管中，加入5 mL70%甲醇溶液，超声提取30 min，混匀，取1 mL超声提取液12 000 r·min离心15 min后，取上清液备用。另等量吸取各供试品溶液100 µL，混匀，制成质量控制（quality control，QC）样品，用于监测分析系统和方法的稳定性。

表3 施用不同浓度多效唑的麦冬样品信息
Tab 3 Information of Ophiopogonis Radix samples treated with different concentrations of paclobutrazol

样品编号 多效唑施用量/（g·m－2）D0 D1 D2 D3 0 1.0 4.0 8.0

2.2.2 检测条件 色谱条件：Waters ACQUITY BEH C色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 µm），流动相为0.1%的甲酸水溶液（A）-0.1%的甲酸乙腈溶液（B），梯度洗脱（0～5 min，2%～40%B；5～17 min，40%～98%B；17～20 min，98%B；20.1～21 min，2%B），流速为0.3 mL·min，柱温40℃，进样量2.0µL。质谱条件：离子源为电喷雾（electrospray ionization，ESI）源；采用MS负离子扫描模式，毛细管电压2.0 kV，离子源温度120℃，脱溶剂气温度450℃，脱溶剂气流速800 L·h，锥孔电压40 V，锥孔气流速50 L·h，采集模式质量范围

m

/

z

50～1500，扫描时间0.2 s，高能通道碰撞电压10～75 V，亮氨酸-脑啡肽

m

/

z

556.2615[M-H]作质量实时校正。

2.2.3 数据采集与分析

① 数据采集：分析样品前测试空白溶剂样品，扣除色谱柱和系统中的残留污染干扰。连续进样10次QC样品，待仪器检测稳定后，进行实际样品检测。实际样品随机排列，并按采样数量等间隔插入QC样品。

② 数据分析：将LC-MS的原始数据导入Progenesis QI 软件（Version 2.0，Waters）进行预处理，得到包含保留时间、质荷比和峰强度的二维数据矩阵，保存为.csv格式，MetaboAnalyst 4.0（https：//www.metaboanalyst.ca）网站有监督的偏最小二乘判别分析（partial least square discriminant analysis，PLS-DA），通过多元统计分析判断多效唑施用对麦冬整体化学成分的影响。多元统计分析结果见图2，结果中清水对照组麦冬与多效唑不同浓度的麦冬分布在不同区域，可见，施用多效唑对麦冬整体化学成分存在显著的影响。

图2 多效唑对麦冬整体化学成分影响的多元统计分析（PLS-DA）Fig 2 Multivariate statistical analysis of the effect of paclobutrazol on the whole chemical constituents of Ophiopogonis Radix（PLS-DA）

2.3 多效唑对麦冬总皂苷和总黄酮的影响

采用紫外分光光度法对“2.2.1”项下的麦冬药材进行总皂苷和总黄酮的含量测定，分析多效唑施用对麦冬总皂苷和总黄酮的影响。总皂苷样品制备及检测方法参照2020年版《中国药典》，总黄酮样品制备及检测方法参考文献报道，采用橙皮苷为对照品进行测定。结果见表5，施用多效唑后麦冬总黄酮含量明显降低，而麦冬总皂苷含量无变化。

表5 多效唑施用量对麦冬总皂苷、总黄酮的影响(＝3)
Tab 5 Effect of paclobutrazol on total saponins and flavonoids of Ophiopogonis Radix(＝3)

样品编号 总皂苷含量/% 总黄酮含量/%D0 D1 D2 D3 0.40 0.40 0.40 0.40 0.021 0.014 0.014 0.014

3 讨论

3.1 测定方法的考察

本研究前期采用液相方法检测麦冬药材中多效唑残留情况，发现色谱峰无法准确定量，故选择采用质谱仪建立麦冬多效唑残留的检测方法。考察了甲醇、80%甲醇、异丙醇3种不同提取溶剂对麦冬中多效唑残留提取效率的影响，结果发现异丙醇提取效率最高，故提取溶剂选择异丙醇。多效唑残留在果蔬和土壤中的检测报道较多，近几年，中药材尤其是川麦冬中多效唑残留检测方法研究增多，大都采用液相色谱-质谱联用方法。由于样品中多效唑残留量较低，文献报道的麦冬多效唑检测方法多采用液液萃取法和QuEChERS法提取，方法复杂，且耗时长。本研究采用异丙醇为溶剂，直接超声提取，浓缩富集后测定，方法更加简便、快捷。

3.2 麦冬药材中多效唑残留分析

多效唑是一种三唑类植物生长调节剂，20世纪80年代研制出后被广泛用于块根类植物增产，其机制是通过抑制植物内源性激素赤霉素的合成提高植物组织中吲哚乙酸氧化酶活性，从而减弱植物顶端分裂活性，促进植物块根形成。多效唑具有低毒性，人体每日允许摄入量为0.1 mg·kg，我国规定部分果蔬中多效唑检出限量为0.05 mg·kg。中药材中尚无相关限量标准，据报道，多效唑施用后在土壤中残留情况较为严重，残留年限可达2年，对土壤微生物及后茬作物均有影响。因此，加快建立中药材多效唑残留限量标准，对中药材安全性控制和土壤环境安全保护均有一定的价值。本研究检测结果中四川麦冬栽培品普遍可检出多效唑残留，残留量在0.002～0.05 mg·kg，而湖南和上海的野生麦冬则无多效唑残留检出。这说明，川麦冬药材栽培品施用多效唑情况较为普遍，药材种植过程中多效唑施用量各不相同。据文献报道，川麦冬种植过程存在多效唑滥用情况，有学者采用质谱法测定了60批川麦冬中108种植物生长激素残留，其中多效唑检出率高达100%，检出质量浓度在0.004 18～0.0639 mg·kg，在108种激素中施用情况最为严重。也有学者采用QuEChERS提取与反相色谱-质谱联用方法测定麦冬药材中多效唑和烯效唑的残留，在33批药材样品中多效唑的检出率为94%，而烯效唑的检出率仅为27%，多效唑残留量在0.02～0.208 mg·kg。本研究结果与文献报道具有高度一致性。因此，本研究建立的快速测定麦冬多效唑残留的方法可为中药材生长调节剂限量评估提供研究基础，为国家监管部门形成针对中药材生长激素残留限量的标准提供一定参考。

3.3 施用多效唑对麦冬成分的影响

本试验通过UPLC-QTOF-MS植物代谢组学技术和多元统计分析方法研究多效唑施用对麦冬整体化学成分的影响，发现多效唑施用后对麦冬的化学成分存在影响，通过测定麦冬总皂苷、总黄酮的含量，初步判断施用多效唑后麦冬总黄酮含量下降。