三方益子膏的质量标准研究

陈海燕，随家宁，黄婉清，农丽惠，冯婷，李芳婵*，蒋林，2，3*（.广西中医药大学，南宁 530200；2.广西壮瑶药工程技术研究中心，南宁 530200；3.广西高校中药制剂共性技术研发重点实验室，南宁 530200）

三方益子方由三个古代经典名方加减化裁而来，由盐益智、盐补骨脂、乌药、金樱子、酒覆盆子、酒黄精、枸杞子、桑葚、芡实、酒苁蓉和炙甘草11 味药组成，具暖肾祛寒、温脾养肝、缩尿止遗的功效。方中益智仁能温肾暖脾、固精缩尿，补骨脂能温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻，盐炙能缓和辛窜湿燥之性，并可引药入肾，增强补肾健脾之功效，两者共为君药。乌药能行气止痛、温肾散寒，能除膀胱和肾间冷气、止小便频数，为臣药。肉苁蓉能补肾阳、益精血、润肠道，为佐药。甘草益气补中、调和药性，为使药。

在选择含量测定对象时，要全面且科学，按君臣佐使选择重点质量标志物，文献表明，5-羟甲基糠醛是食品和药品中普遍存在的共性成分，具有保肝、改善学习记忆、保护神经系统、抗炎、抗氧化等多种功效，且可促进甘草酸的代谢，加强抑制肿瘤、抗炎、降低血中胆固醇的作用，本方中盐益智、黄精、枸杞子、桑葚、酒苁蓉、炙甘草均含有该成分，覆盖君臣佐使药。方中盐益智、金樱子、桑葚、枸杞子均含有原儿茶酸，该化合物可通过抗氧化应激活性发挥保肝作用。单体松果菊苷为肉苁蓉中的保肝活性成分，补骨脂素和异补骨脂素是补骨脂中的主要活性成分之一，甘草中的甘草酸具改善肾功能的作用。为提升和完善三方益子膏质量标准，确保临床用药的安全，本研究拟采用薄层色谱法对三方益子膏中盐益智、盐补骨脂、乌药、酒苁蓉、炙甘草5 味药材进行定性鉴别，采用高效液相法测定有效成分5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素和甘草酸含量，为三方益子膏的质量标准起草提供依据。

1 材料

1.1 仪器

安捷伦1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦科技公司）；超纯水仪一体机Direct-Q5UV（广西南宁市博美生物科技有限公司）；KQ-500E 超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；SQP 十万分之一电子天平[赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]；DZF-6090 真空干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；HH-4 恒温水浴锅（常州国华电器有限公司）；AR204E 千分之一电子天平[奥豪斯仪器（常州）有限公司]。

1.2 试药

甲醇（批号：2020102902）、乙醇（批号：2019121602）、乙酸乙酯（批号：2020081101）、冰醋酸（批号：2018081301）、 硫酸（批号：2018082901）、正丁醇（批号：2019032201）、石油醚（批号：2020072701）（成都市科隆化学品有限公司）；36%醋酸（上海阿拉丁生化技术有限公司）；甲酸（批号：2019040802，天津市大茂化学试剂厂）；正己烷（批号：2020080501）、环己烷（批号：2019071802）（天津市富宇精细化工有限公司）；色谱级乙腈[赛默飞世尔科技（中国）有限公司]；分析级磷酸（批号：20190606，成都金山化学试剂有限公司）；蜂蜜（湖南药圣堂中药科技有限公司）；阿斯帕坦（南宁市越前食品添加剂有限责任公司）；对照药材益智仁（批号：121590-202003）、 补骨脂（批号：121056-201605）、乌药（批号：121096-201907）、肉苁蓉（批号：121101-201603）、甘草（批号：120904-202021）； 对照品原儿茶酸（批号：110809-201906）、松果菊苷（批号：110749-201919）、补骨脂素（批号：111525-201912）、异补骨脂素（批号：110736-201943）、5-羟甲基糠醛（批号：110629-201919）（含量＞98%，中国食品药品检定研究院）；对照品甘草酸（批号：RP190517，含量：99.34%，成都麦德生科技有限公司）；薄层样品（批号：20201001、20201002、20201003），S1 ～S10 号样品（批号：20210301，20210302，20210303，20210304，20210305，20210306，20210307，20210308，20210309，202103010）（由广西中医药大学广西壮瑶药工程中心实验室自制，规格：180 g/瓶）。

2 三方益子膏的制备

按处方量称取盐益智、盐补骨脂、乌药、金樱子、酒覆盆等11 味药材，加14 倍量水提取2 次，每次2 h，滤过，浓缩至相对密度为1.40 ～1.45（80 ～90℃），添加辅料蜂蜜∶阿斯帕坦（10∶0.1）适量，搅拌均匀，分装，灭菌，即得（1 g 膏滋相当于1.842 g 生药量）。

3 薄层鉴别

3.1 益智仁的薄层鉴别

取三方益子膏3 g（批号：20201001、20201002、20201003），加纯水20 mL，用石油醚萃取2 次，每次40 mL，合并石油醚层，蒸干，残渣用1 mL 甲醇溶解，作为供试品溶液。取益智仁对照药材1 g 于具塞锥形瓶中，加入石油醚30 mL，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣用1 mL 甲醇溶解，即得对照药材溶液。按处方比例称取除益智仁外的10 味药材，按制备工艺制备成膏滋，再同法制得缺益智仁阴性样品溶液。照薄层色谱法试验，各吸取供试品溶液和阴性样品溶液15 µL，益智仁药材溶液4 µL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以环己烷-乙酸乙酯（3∶1）为展开剂，饱和10 min，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热5 min，置日光灯下检视。结果如图1。

图1 益智仁薄层色谱图Fig 1 TLC of Alpiniae Oxyphyllae Fructus

3.2 补骨脂的薄层鉴别

取三方益子膏3 g（批号：20201001、20201002、20201003）于具塞锥形瓶中，加乙酸乙酯20 mL，超声15 min（功率200 W，频率40 kHz），滤过，滤液蒸干，残渣加乙酸乙酯1 mL使溶解，作为供试品溶液。取补骨脂对照药材1 g 于具塞锥形瓶中，加20 mL 乙酸乙酯，超声15 min（功率200 W，频率40 kHz），滤过，滤液蒸干，残渣加1 mL 乙酸乙酯使溶解，即得补骨脂对照药材溶液。取补骨脂素对照品、异补骨脂素对照品，加乙酸乙酯制成每1 mL 各含2 mg 的混合溶液。称取除补骨脂以外的10 味药材，按制备工艺制备成膏滋，同法制得阴性样品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液、阴性样品溶液和补骨脂药材溶液2 µL，对照品溶液1 µL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）为展开剂，饱和10 min，展开，取出，晾干，喷以10%氢氧化钠乙醇溶液，吹干，置紫外光灯下（365 nm）下检视。结果如图2。

图2 补骨脂薄层色谱图Fig 2 TLC of Psoraleae

3.3 乌药薄层鉴别

取三方益子膏3 g（批号：20201001、20201002、20201003）于具塞锥形瓶中，加甲醇20 mL，超声30 min（功率200 W，频率40 kHz），滤过，滤液挥干，用10 mL 纯水溶解，再用氯仿萃取3 次，每次20 mL，合并氯仿层，蒸干，残渣加1 mL 甲醇溶解，作为供试品溶液。取乌药对照药材1 g 于具塞锥形瓶中，加甲醇20 mL，超声30 min（功率200 W，频率40 kHz），滤过，滤液挥干，用10 mL 纯水溶解，再用氯仿萃取3 次，每次20 mL，合并氯仿层，蒸干，残渣加1 mL 甲醇溶解，即得乌药对照药材溶液。称取除乌药以外的10 味药材，按制备工艺制备成膏滋，同法制得阴性样品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和阴性样品溶液各12 µL，乌药药材溶液3 µL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶1.5∶0.1）为展开剂，饱和10 min，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加热5 min，置紫外光灯下（365 nm）下检视。结果见图3。

图3 乌药薄层色谱展开图Fig 3 TLC of Lindera Radix

3.4 酒苁蓉薄层鉴别

取三方益子膏3 g（批号：20201001、20201002、20201003）于具塞锥形瓶中，加25 mL 甲醇，超声提取30 min（功率200 W，频率40 kHz），过滤，滤液挥干，用25 mL 纯水溶解，再用水饱和正丁醇溶液萃取3 次，每次25 mL，合并正丁醇层，用水洗涤2 次，每次40 mL，合并正丁醇层，蒸干，残渣加2 mL 甲醇溶解，作为供试品溶液。取肉苁蓉对照药材1 g 于具塞锥形瓶中，加25 mL 甲醇，超声提取30 min（功率200 W，频率40 kHz），过滤，滤液挥干，用25 mL 纯水溶解，再用水饱和正丁醇溶液萃取3 次，每次25 mL，合并正丁醇层，用水洗涤2 次，每次40 mL，合并正丁醇层，蒸干，残渣加2 mL 甲醇溶解，作为对照药材溶液。取毛蕊花糖苷对照品适量，加甲醇溶解并定容，制得毛蕊花糖苷质量浓度为1.045 mg·mL的对照品溶液。称取除肉苁蓉以外的10 味药材，按制备工艺制备成膏滋，同法制得阴性样品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和阴性样品溶液各7 µL，肉苁蓉药材溶液2 µL，毛蕊花糖苷对照品液2 µL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以醋酸乙酯-甲醇-9%醋酸溶液（15∶3∶2）为展开剂，饱和10 min，展开，取出，晾干，喷以5%三氯化铁乙醇溶液，吹干，置日光下检视。结果见图4。

图4 肉苁蓉薄层色谱图Fig 4 TLC of Cistanches Herba

3.5 炙甘草薄层鉴别

取三方益子膏3 g（批号：20201001、20201002、20201003）于具塞锥形瓶中，加甲醇30 mL，回流提取1 h，滤过，滤液蒸干，用40 mL 水溶解，用正丁醇提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇层，用水洗涤2 次，每次40 mL，合并正丁醇层，蒸干，残渣加5 mL 甲醇溶解，作为供试品溶液。取甘草对照药材1 g 于具塞锥形瓶中，加甲醇30 mL，回流提取1 h，滤过，滤液蒸干，用40 mL 水溶解，用正丁醇提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇层，用水洗涤2 次，每次40 mL，合并正丁醇层，蒸干，残渣加5 mL 甲醇溶解，作为对照药材溶液。称取除甘草以外的10 味药材，按制备工艺制备成膏滋，同法制得阴性样品溶液。照薄层色谱法试验，吸取供试品溶液和阴性样品溶液各13 µL，甘草对照药材溶液2 µL，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-水（18∶7∶1）为展开剂，饱和10 min，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，105℃加热5 min，置日光下检视。结果见图5。

图5 炙甘草薄层色谱图Fig 5 TLC of Grilled Glycyrrhiza

4 三方益子膏中有效成分含量的测定

4.1 色谱条件

采用Agilent 5 TC-C（2）（4.6 mm×250 mm，5 µm）色谱柱；流动相为乙腈（B）-0.1%磷酸水溶液（A），梯度洗脱（0 ～5 min，5%B；5 ～12 min，7%B；12 ～26 min，15%B；26 ～35 min，40%B；35 ～45 min，50%B；45 ～60 min，85%B）；切换波长检测（0 ～15 min，260 nm；15 ～30 min，330 nm；30 ～60 min，252 nm）；柱温35℃；流速1.0 mL·min；进样量10 μL。

4.2 供试品溶液的制备

称取三方益子膏（批号：20201002）3 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定重量，超声30 min（功率200 W，频率40 kHz），放冷至室温，再次称重，用甲醇补足减失的重量，即得供试品溶液。

4.3 对照品溶液的制备

精密称取5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素和甘草酸对照品各适量，加甲醇溶解，配制成质量浓度分别为0.263、0.017、0.098、0.038、0.049、0.078 mg·mL的混合对照品溶液。

4.4 阴性样品溶液的制备

按处方比例称取相应药材，按制备工艺制成膏滋。称取各膏滋适量，按“4.2”项下方法制备阴性样品溶液A（缺盐益智、黄精、枸杞子、桑葚、酒苁蓉、炙甘草），阴性样品溶液B（缺盐益智、金樱子、桑葚、枸杞子），阴性样品溶液C（缺补骨脂），阴性样品溶液D（缺肉苁蓉）及阴性样品溶液E（缺甘草）。

4.5 方法学考察

4.5.1 专属性考察 分别取混合对照品溶液、样品溶液、阴性样品溶液进样分析，结果样品中色谱峰保留时间与对照品相应的色谱峰保留时间一致，各峰分离度、对称性较好，各阴性样品对测定无影响，理论塔板数以原儿茶酸计不低于10 000，色谱图见图6。

图6 三方益子膏专属性试验HPLC 图谱Fig 6 HPLC chromatogram of specificity test for SanfangYizi ointment

4.5.2 线性关系考察 取“4.3”项下混合对照品溶液，稀释成系列浓度混合对照品溶液，进样测定，记录峰面积，以峰面积（

Y

）为纵坐标，进样量（

X

，μg）为横坐标进行线性回归，求得各成分的回归方程，5-羟甲基糠醛：

Y

＝2832.16

X

＋43.45，

r

＝0.9999；原儿茶酸：

Y

＝3129.93

X

＋3.78，

r

＝0.9999；松果菊苷：

Y

＝1196.98

X

＋5.68，

r

＝0.9999；补骨脂素：

Y

＝5847.81

X

＋11.45，

r

＝0.9999；异补骨脂素：

Y

＝5404.57

X

＋18.96，

r

＝0.9999；甘草酸：

Y

＝804.76

X

＋2.79，

r

＝0.9999；5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸分别在0.526 ～2.63 μg、0.034 ～0.17 μg、0.196 ～0.98 μg、0.076 ～0.38 μg、0.098 ～0.49 μg、0.156 ～0.78 μg 与峰面积线性关系良好。4.5.3 精密度试验 取“4.3”项下混合对照品溶液连续进样6 次，记录相应的峰面积。结果5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸峰面积的

RSD

分别为0.10%、0.13%、0.080%、0.080%、0.090%、0.060%， 显示仪器精密度良好。4.5.4 重复性试验 准确称取三方益子膏（批号：20201002）6 份，各3 g，精密称定，按“4.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸的平均含量分别为2.121、0.167、0.843、0.295、0.432、0.658 mg·g，

RSD

分别为0.50%、1.1%、0.57%、0.38%、0.48%、0.37%，表明该方法的重复性良好。4.5.5 稳定性试验 按照“4.2”项下方法制备三方益子膏（批号：20201002）供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h 进样测定，结果5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸含量的

RSD

分别为1.0%、0.84%、1.4%、0.77%、0.76%、0.96%，表明供试品溶液24 h 内稳定。4.5.6 加样回收试验 称取三方益子膏（批号：20201002）1.5 g，共6 份，分别加入适量的5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸对照品，制备成供试品溶液进样测定，结果5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸的平均加样回收率为101.75%、97.54%、101.90%、97.82%、96.56%、99.11%，

RSD

分别为1.2%、2.4%、1.9%、1.6%、1.0%、1.8%。

4.6 样品含量测定

取S1 ～S10 样品各3 g，按“4.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，结果见表1。10 批三方益子膏中5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸的平均含量分别为0.863、0.187、2.323、0.145、0.185、0.631 mg·g。按照制剂含量测定范围不得低于80%计算，10 批三方益子膏中5-羟甲基糠醛、原儿茶酸、松果菊苷、补骨脂素、异补骨脂素、甘草酸的含量分别不得低于0.690、0.149、1.858、0.116、0.147 和0.504 mg·g。

表1 10 批样品的含量测定结果(mg·g)
Tab 1 Content determination of 10 batches of samples (mg·g)

样品5-羟甲基糠醛原儿茶酸松果菊苷补骨脂素异补骨脂素甘草酸S11.004 0.171 2.178 0.139 0.185 0.606 S20.802 0.171 2.215 0.137 0.180 0.544 S30.904 0.212 2.501 0.150 0.194 0.681 S40.808 0.213 2.292 0.135 0.162 0.671 S50.883 0.184 2.265 0.153 0.184 0.641 S60.791 0.204 2.557 0.154 0.182 0.675 S70.898 0.189 2.348 0.159 0.198 0.611 S80.853 0.190 2.049 0.147 0.187 0.589 S90.802 0.158 2.454 0.147 0.197 0.639 S100.889 0.176 2.374 0.134 0.180 0.653平均值0.863 0.187 2.323 0.145 0.185 0.631

5 讨论

本研究建立了三方益子膏的薄层鉴别方法，在盐益智、盐补骨脂、乌药、酒苁蓉、炙甘草薄层鉴别的过程中，分别考察了湿度、温度、不同展开剂以及不同薄层板对样品展开的影响，发现环己烷-乙酸乙酯（3∶1）、正己烷-乙酸乙酯（4∶1）、苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶1.5∶0.1）、醋酸乙酯-甲醇-9%醋酸溶液（15∶3∶2）、三氯甲烷-甲醇-水（18∶7∶1）作为盐益智、盐补骨脂、乌药、酒苁蓉、炙甘草的鉴别展开剂，斑点均明亮清晰、分离效果均较好，并且无拖尾现象。在含量测定方法中，分别考察了甲醇-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液4 种流动相，结果在以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相时的峰形与分离度均良好。

本研究对三方益子膏中盐益智、盐补骨脂、乌药、酒苁蓉、炙甘草5 味药材进行薄层色谱法系统研究，覆盖处方的君臣佐使药，建立了合理、有效的三方益子膏主要成分的薄层鉴别方法；所建立的HPLC 方法，灵敏度高，准确性好，可作为三方益子膏的定量分析方法，为三方益子膏的质量标准的建立提供依据。