肾复舒颗粒通过调节炎症和纤维化延缓糖尿病肾病的发展

2022-09-13杨永玉姜思怡葛星成向大雄中南大学湘雅二医院药学部长沙10011湖南省转化医学与创新药物工程技术研究中心长沙10007岳阳职业技术学院药学系湖南岳阳1000湖南中医药大学湘杏学院长沙10208

中南药学 2022年6期

杨永玉，姜思怡，葛星成，向大雄*（1.中南大学湘雅二医院药学部，长沙 10011；2.湖南省转化医学与创新药物工程技术研究中心，长沙 10007；.岳阳职业技术学院药学系，湖南岳阳 1000；.湖南中医药大学湘杏学院，长沙 10208）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是由糖尿病引起的以尿蛋白升高、肾小球滤过率下降为特征的慢性肾脏疾病，是糖尿病最常见和最严重的微血管并发症之一，也是目前引起终末期肾病的首要原因。大量证据表明炎症和纤维化参与了DN 的发生、发展。抑制肾脏炎症信号通路中重要的转录因子NF-

B（nuclear factorkappa B）以及纤维化信号通路TGF-

/Smad2/3可明显延缓DN 的进展。目前，对进展期的DN 均无有效的药物可以逆转疾病进程，仅能延缓肾病进展。

肾复舒颗粒（Shenfushu granule，SFSG）是由中南大学湘雅二医院临床专家针对肾衰竭自主研发的医院制剂，其由大黄、丹参、甘草、土茯苓、枳壳、牡蛎六味中药材组成。SFSG 主要用于各种急、慢性肾衰竭及尿毒症的治疗。研究发现SFSG 可降低5/6 肾切除大鼠的血尿素氮、肌酐和尿蛋白水平，降低肾小球硬化和肾小管间质损伤，增加微血管密度。临床研究显示SFSG 能降低慢性肾衰患者血液中硫酸吲哚酚浓度。此外，SFSG 也用于DN 患者的治疗。本文研究了SFSG 对DN 进展的保护作用，从抗肾脏炎症以及纤维化的角度探讨可能的作用机制，为SFSG 的进一步开发和临床使用提供实验支持。

1 材料

SFSG 提取物（中南大学湘雅二医院药学部自制）。HE、PAS 和Masson’s 染色液（北京索莱宝科技有限公司）。

-actin（BM0627）、fibronectin（BA1772）、collagen4A1（BA3585）、IL-6（EK0411）和TNF-

（FEK0527）（博士德生物公司）；p-IKK

（ser176）抗体（Santa Cruz 公司，Sc-21661）。NF

B p65（AF-1234）、p-Smad2（Ser250）（AF2545）和TGF-

（AF0297）抗体、RIPA 裂解液和BCA 法蛋白定量试剂盒（碧云天生物技术公司）。p-NF-

B p65（S536）抗体（abcam 公司，ab76302），IKK

抗体（Affinity 公司，AF6014）。血糖、肌酐、尿素氮、尿微量白蛋白测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。链脲佐菌素（STZ，上海阿拉丁生化科技股份有限公司）。

2 方法

2.1 SFSG 提取物的制备

取大黄781 g，丹参625 g，土茯苓469 g，牡蛎156 g，枳壳312 g，甘草625 g，加水浸泡8 ～12 h，煎煮两次，每次1.5 h，合并滤液，减压浓缩至相对密度为1.15 ～1.30（60 ℃）的浸膏，喷雾干燥，即得SFSG 提取物。

2.2 动物分组及造模

C57BL/6J 小鼠40 只，体质量18 ～22 g[湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物生产及使用许可证：SCXK（湘）2019-0004]。小鼠适应性喂养1 周，自由进食与饮水，饲养温度（25±2）℃，湿度40%～60%。将小鼠随机分为正常对照组和模型组。禁食过夜后，模型组小鼠连续腹腔注射STZ [60 mg·kg，0.1 mol·L柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液，pH 4.0）配制]5 d，正常对照组小鼠注射相同体积的0.1 mol·L的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。48 h 后测定血糖，血糖浓度≥16.7 mmol·L认为1 型糖尿病小鼠模型构建成功。一周后，将模型组建模成功小鼠分为模型对照组、SFSG 组以及阳性药物组，每组10 只。SFSG 组小鼠灌胃给予2.08 g/（kg·d）的SFSG 提取物[0.5%的羧甲基纤维素钠（0.5%CMC-Na）混悬]。小鼠给药剂量换算依据为：人用最大剂量为16 g 提取物·d，按照体表面积计算小鼠使用剂量为2.08 g/（kg·d）。阳性药物组给予缬沙坦40 mg/（kg·d），给药体积为0.20 mL。正常对照组和模型对照组给予0.2 mL0.5%CMC-Na 溶液。给药12 周后收集尿液，测定体质量。将动物处死，收集血样和肾脏组织，对相应指标进行检测。

2.3 血糖、血尿素氮和血肌酐的测定

采集血液样本，室温下放置30 min，自然凝固。4℃、3000 r·min离心15 min，收集上清液。分别使用相应的生化试剂盒测定血清中血糖、肌酐和血尿素氮（BUN）的含量。

2.4 尿微量白蛋白的测定

收集各组小鼠24 h 的尿液，采用尿微量白蛋白测定试剂盒测定24 h 尿白蛋白含量。

2.5 组织染色

肾脏组织用4%的多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，切片后，脱蜡。分别按照HE、PAS 或Masson’s 染色试剂盒染色，在光镜下观察、拍照。

2.6 组织炎症因子指标检测

取肾脏组织约100 mg，加入试剂盒中匀浆液后用匀浆机打碎。12 000 r·min、4℃离心15 min，取上清液。测定上清液中IL-6 和TNF-

的浓度。

2.7 Western blot 分析

取适量肾组织，按照每 100 mg 组织加入1 mL RIPA 蛋白裂解液、10 μL 丝氨酸蛋白酶及巯基蛋白酶抑制剂。在冰浴条件下充分研磨，裂解30 min，4℃、12 000 r·min离心15 min。取上清液，BCA 法测定蛋白浓度。配制10%的SDSPAGE 胶，每个凝胶孔中加入30 μg 的蛋白样品。电泳完成后将蛋白转印至聚偏二氟乙烯膜上。5%脱脂奶粉室温下封闭非特异性抗原1 h，加入一抗[

-actin、fibronectin、collagen4A1、p-IKK

（ser176）、IKK

、NF-

B p65、TGF-

、p-Smad2（Ser250）以及p-NF-

B p65（S536），1∶500 稀释]抗体，4 ℃孵育过夜。用TBS-T 洗膜3 次，每次5 min。然后加入辣根过氧化物酶标记的二抗（1∶5000 稀释），37℃孵育1 h。TBS-T 洗膜3次，每次5 min。ECL 发光液显影成像。

2.8 统计分析

采用SPSS20.0 软件进行统计学分析，数据用

表示。两组数据用

检验分析，多组间比较用Student-Newman-Keuls’t（SNK）分析以及Tukey’s 检验，

＜0.05表示差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 SFSG 延缓DN 的进展

与正常对照组相比，模型对照组小鼠血糖、血尿素氮、血肌酐、24 h 尿微量白蛋白以及尿微量白蛋白与肌酐比（ACR）升高，而体质量降低。与模型对照组相比，SFSG 对血糖和体质量没有影响；SFSG 降低DN 小鼠血尿素氮、血肌酐、尿微量白蛋白和ACR 水平（见图1）。

图1 肾复舒颗粒对DN 进展的影响Fig 1 Effect of SFSG on the development of DN

3.2 SFSG 改善DN 小鼠肾脏损伤

HE 染色结果表明，与正常对照组相比，模型对照组小鼠肾小球体积明显增加；相比于模型对照组，SFSG 组小鼠的肾小球面积明显降低（见图2A 和2B）。PAS 染色结果显示模型对照组小鼠肾小球系膜基质含量增加，SFSG 可明显降低系膜基质的含量（见图3C 和3D），这些结果说明SFSG 对DN 小鼠肾脏损伤具有保护作用。

图2 SFSG 对DN 小鼠肾脏损伤的影响Fig 2 Effect of SFSG on kidney tissue damage of DN mice

3.3 SFSG 改善DN 小鼠肾组织的炎症水平

与正常对照组相比，模型对照组小鼠肾脏组织中IL-6 和TNF-

的水平显著升高。与模型对照组相比，SFSG 给药组IL-6 和TNF-

的水平显著降低（见图3A 和3B）。NF-

B 的磷酸化影响其转录活性，而IKK 复合物是NF-

B 信号通路的主要调节蛋白。与正常对照组相比，模型对照组小鼠肾脏组织中p-NF-

B p65（S536）/NF-

B p65 以及p-IKK

（ser176）/ IKK

的水平明显增加，而SFSG 可抑制p-NF-

B p65（S536）/NF-

B p65 以及p-IKK

（ser176）/ IKK

水平的增加。这些结果表明SFSG 改善DN 小鼠肾组织的炎症水平。

图3 SFSG 对DN 小鼠肾脏炎症水平的影响Fig 3 Effect of SFSG on the inflammatory levels of kidney of DN mice

3.4 SFSG 降低DN 小鼠肾脏纤维化

Masson’s 染色结果显示，与正常对照组相比，模型对照组小鼠肾小球和肾小管中胶原纤维的含量显著升高；而相比于模型对照组，SFSG可抑制肾脏组织中胶原纤维的升高（见图4A）。TGF-

1/Smads 信号通路在肾脏纤维化发生、发展过程中发挥重要作用。相比于正常对照组，模型对照组小鼠肾脏组织中p-smad2（ser250）、TGF-

、fibronectin 以及collagen4A1 的表达明显升高，而SFSG 可显著抑制这种改变（见图4B）。

图4 SFSG 对DN 小鼠肾脏纤维化的影响Fig 4 Effect of SFSG on the renal fibrosis of DN mice

4 讨论

长期高血糖与DN 的进展密切相关，高血糖使肾脏血流动力学和代谢途径改变，引起致肾损伤的不同信号通路的激活。通过控制患者的血糖水平，可延迟DN 的进展。DN 的发病机制复杂，多种因素参与了其发病机制，包括晚期糖基化终产物的积聚、血流动力学变化、炎症反应、自噬、细胞死亡和表观遗传调控等。DN最具特征性的病理改变是肾小球肥大、基底膜增厚、肾小球系膜和肾小管间质基质扩张。目前仍然缺乏针对DN 的特异性治疗方法。深入研究DN 的发病机制，开发有效的治疗药物，对DN的防治极为重要。临床应用证明SFSG 是一种安全、有效的治疗慢性肾衰的药物。本研究发现SFSG 可降低DN 小鼠血肌酐、血尿素氮以及尿微量白蛋白的水平，说明SFSG 可延缓DN 的进展。

目前，大量证据表明炎症在DN 的发病机制中起重要作用。活化的NF-

B 经核转位后调节细胞因子的转录，产生各种趋化因子和炎症因子。在正常状态，NF-

B 与I

B 形成复合物存在于胞质中，应激状态下，活化的IKK

使I

B 磷酸化进而降解，激活NF-

B。本实验结果显示，SFSG 降低DN 小鼠肾脏组织中炎症因子IL-6 和TNF-

的水平，同时降低NF-

B 和IKK 的磷酸化水平。这些研究表明SFSG 可抑制DN 小鼠肾脏的炎症水平。在病理学上，DN 患者的肾脏经历了多种变化，包括细胞外基质蛋白的沉积、肾小球基底膜增厚和肾小管萎缩，最终导致间质纤维化和肾小球硬化。纤维化的特征是细胞外基质如fibronectin 和collagen4A1 的沉积增加。高糖及其代谢产物可诱导TGF-

1 的表达增加。TGF-

1 通过与 TGF-

受体 2（TGFBR2）结合后激活TGFBR1，导致 Smad2/3 的募集。激活的Smad2/3 复合物转移到细胞核中，转录下游基因，如fibronectin。阻断 TGF-

/Smad 信号传导可有效防止DN 的进展。本研究结果显示SFSG 可降低DN 小鼠肾脏组织的纤维化，以及降低TGF-

、p-Smad2（Ser250）、fibronectin 和collagen4A1 的表达，均说明SFSG 对DN 小鼠肾脏纤维化有抑制作用。

本研究发现SFSG 可明显延缓DN 的进展，其机制可能与抑制肾脏炎症以及纤维化有关。本研究为SFSG 治疗慢性肾衰的作用提供了实验依据。