基于网络药理学的复方杜仲健骨颗粒作用机制解析研究

舒展，任越，陈紫军，张燕玲（北京中医药大学中药学院 国家中医药管理局中药信息工程重点实验室，北京 102488）

复方杜仲健骨颗粒由杜仲、白芍、续断、黄芪、枸杞子、牛膝、三七、鸡血藤、人参、当归、黄柏、威灵仙12 味中药组成。该药为红棕色的颗粒，微苦，具有滋补肝肾、养血荣筋、通络止痛的功效，临床上主要用于膝关节骨性关节炎、缺血性股骨头坏死等骨关节疾病的治疗。方中君药为杜仲，可补肝肾、强筋骨。黄芪、续断、白芍为臣药，具有养血荣筋、补气固表、柔肝止痛、调血脉、解痉抗炎、免疫调节的作用。人参、牛膝、当归、枸杞子、黄柏、三七、鸡血藤为佐药，具有补肝肾、益精气、坚筋骨、消肿定痛的作用。威灵仙作为佐药，发挥祛风湿、通经络、止痛的功效。现代药理学研究证实，复方杜仲健骨颗粒可以有效改善骨关节疾病，其提取液能直接作用于软骨细胞，改善新陈代谢，进而维护关节软骨的正常构造和功能，防止骨关节炎疾病的进一步发展。

然而复方杜仲健骨颗粒的组成中药众多，且化学成分复杂，其发挥作用的具体机制尚不清楚。网络药理学的研究思路与中医药多成分、多靶标、系统调控的理念相一致，将其应用于中药研究能够明确药效物质和疾病的关系，揭示药物的作用机制，具有独到的优势和广阔的前景。因此，本研究通过数据库收集复方杜仲健骨颗粒的化学成分及其潜在作用靶标，分析其生物功能及信号通路，以期从分子网络水平上研究复方杜仲健骨颗粒整体的作用机制，并对部分药理作用和关键靶标进行生物验证，进而评价网络药理学分析方法的合理性和准确性。

1 材料与方法

1.1 基于网络药理学的复方杜仲健骨颗粒作用机制研究

1.1.1 复方杜仲健骨颗粒中药成分及靶标筛选及收集 通过中药化学成分数据库（Traditional Chinese Medicine Database，TCMD）和中药系统药理学数据库TCMSP（http：//www.tcmspw.com/tcmsp.php）收集复方杜仲健骨颗粒12 味中药的化学成分，并通过TCMSP 数据库收集相应成分的靶标。

1.1.2 靶标名称校准 采用UniProt（https：//www.uniprot.org/）数据库中UniProtKB 检索功能，通过输入“1.1.1”项下收集到的蛋白名称，规定物种为“human”，将获得的所有蛋白校正为UniProt ID，从而得到复方杜仲健骨颗粒的化合物潜在作用靶标。

1.1.3 蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络的构建及关键靶标的获取 为明确复方杜仲健骨颗粒靶标间的相互作用，将复方杜仲健骨颗粒潜在作用靶标导入STRING（https：//string-db.org/）平台构建蛋白相互作用网络（protein-protein interaction network，PPI），选择置信度高于0.7 的蛋白互作信息，然后将PPI 网络模型导入Cytoscape 3.8.2软件，利用cytoHubba 插件，计算互作网络中节点的度值（degree），并用度值评价节点在网络中的关键程度。

1.1.4 GO 功能富集分析与KEGG 富集分析 通过DAVID 数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）对得到的化合物潜在作用靶标开展GO 富集分析和KEGG 富集分析。以

P

＜0.05 作为筛选条件，获取复方杜仲健骨颗粒可能作用的GO 富集结果及信号通路。

1.2 复方杜仲健骨颗粒部分药理作用及关键靶标的验证

1.2.1 细胞 小鼠单核巨噬细胞RAW 264.7，购于上海泽叶生物科技有限公司。

1.2.2 仪器与试药 二氧化碳培养箱（美国赛默飞公司）；倒置相差显微镜（德国徕卡公司）；TDL-50B 低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；KQ-500DE 型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；冷冻干燥机（北京博医康技术有限责任公司）。复方杜仲健骨颗粒（批号：2010908，规格每袋12 g，北京双鹤药业销售有限责任公司）；DMEM 高糖培养基（含谷氨酰胺，含丙酮酸钠，货号：06-1055-57-1ACS）、热灭活特级胎牛血清（货号：04-121-1A，BI 公司）；青链霉素（货号：15140122，Invitrogen 公司）；MTT（货号：0793，AMRESCO 公司）；脂多糖（LPS，货号：L2880，LABLEAD 公司）；一氧化氮检测试剂盒（货号：E1030，北京普利莱基因技术有限公司）；无水乙醇（货号：SJ-C1-13-01ZY-017，天津市致远化学试剂有限公司）；氯仿（货号：112050，北京市通广精细化工公司）；异丙醇（货号：10239，美国赛默飞公司）；无DNA酶/RNA 酶去离子水（货号：RT121）、6×Loading Buffer（货号：9156）、D2000 分子量标准（货号：MD114-02）、GeneGreen 核酸染料（货号：RT210）（TIANGEN 公司）；PCR 引物（上海生工公司）；PrimeScript RT reagent Kit（Perfect Real Time）（货号：RR037A）、SYBR Premix Ex Taq II（货号：RR820A）（TAKARA 公司）。

1.2.3 药物配制 称取复方杜仲健骨颗粒10 g 加蒸馏水50 mL，超声破碎90 min（20 kHz），5000 r·min离心15 min。离心后取上清液，利用冷冻干燥机将上清冻干后于－20℃保存，实验前用DMEM 培养液稀释，5000 r·min离心15 min，两次离心后，0.22 μm 滤膜过滤，依次稀释至质量浓度为10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 g·L。

1.2.4 细胞培养及传代 RAW 264.7 细胞培养于含10%热灭活特级胎牛血清、1%青链霉素的DMEM 高糖培养基，于37℃、5%CO条件下培养，次日更换新鲜DMEM 完全培养基。

1.2.5 复方杜仲健骨颗粒细胞毒性评价 RAW 264.7 细胞生长至85%～90%时，制成密度为每孔5×10个的细胞悬液，接种于96 孔板中培养。培养箱孵育24 h 后弃去培养基，每孔加入100 μL 含有不同质量浓度的药物培养基（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 g·L），每组设置4 个复孔，置5% CO、37℃的培养箱中培养24 h 后，每孔加入MTT 溶液（5 mg·mL）100 µL，培养箱内避光孵育4 h 后弃去上清液，每孔加入DMSO 150µL，避光振摇10 min，采用连续光谱扫描式酶标仪在490 nm 波长处测量各孔的吸光度值，并计算各组细胞的存活率。

1.2.6 复方杜仲健骨颗粒对NO 释放的影响RAW 264.7 细胞生长至85%～90%时进行细胞传代，制成密度为每孔5×10个的细胞悬液，接种于96 孔板中培养。培养箱孵育24 h 后，弃去旧的培养液，将96 孔板培养的细胞分为空白对照组、模型组和不同剂量药物组。空白对照组加入完全培养基；模型组加入0.2 μg·LLPS 溶液；药物组加入0.2 μg·LLPS 和不同质量浓度的复方杜仲健骨颗粒（10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125 g·L）混合液。作用24 h 后，采用NO 检测试剂盒测定NO 释放量。

1.2.7 复方杜仲健骨颗粒对

TNF

、

STAT3

、

MAPK1

mRNA 表达的影响 将处于对数期的RAW 264.7细胞以每孔9×10个接种于6 孔板中，每孔2 mL。细胞贴壁24 h 后，设为空白对照组、模型组和药物组，空白对照组加入完全培养基；模型组加入0.2 μg·LLPS 溶液；药物组加入0.2 μg·LLPS 和最大无毒浓度的复方杜仲健骨颗粒混合液，每孔2 mL，培养24 h 后，提取总RNA。使用RNA 逆转录试剂盒进行反转录。RT-qPCR 采用SYBR Green 法。利用2计算目的基因表达量，试验所需引物购自生工生物工程（上海）股份有限公司。目的基因引物序列见表1。

表1 PCR 引物序列
Tab 1 Primer sequence of PCR

靶标正向引物反向引物STAT3AATCTCAACTTCAGACCCGCCAACGCTCCACGATCCTCTCCTCCAG TNFGCGACGTGGAACTGGCAGAAGGTGGTTTGTGAGTGTGAGGGTCTG MAPK1AATAAGGTGCCGTGGAACAGGTTGAAGTCGTCCAGCTCCATGTCAAAC GAPDH（内参）CGTCCCGTAGACAAAATGGTTTGATGGCAACAATCTCCAC

1.2.8 统计学方法 使用GraphPad Prism 5 软件对数据进行处理和统计学分析，组间比较使用单因素方差分析方法（One-way ANOVA），

P

＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基于网络药理学的复方杜仲健骨颗粒作用机制研究

2.1.1 复方杜仲健骨颗粒中药成分及靶标筛选及收集 本研究基于TCMSP 数据库、TCMD 数据库，收集得到复方杜仲健骨颗粒化学成分及对应靶标。去重后得到杜仲相关成分167 个，续断57个，黄芪115 个，三七191 个，黄柏153 个，威灵仙81 个，枸杞102 个，人参326 个，当归161个，白芍112 个，牛膝56 个，鸡血藤71 个。通过TCMSP 收集到337 个靶标蛋白，经UniProt数据库对靶标名称进行校准后去重，共得到有效UniProtID 279 个。

2.1.2 复方杜仲健骨颗粒蛋白互作网络构建与关键靶标的筛选 将279 个潜在靶标录入STRING数据库， 设置interaction score ＞0.7， 利用Cytoscape 3.8.2 进行可视化分析，构建PPI 网络，见图1。对复方杜仲健骨颗粒PPI 的关键靶标进行分析发现，可参与抗炎作用，如TNF、IL-6 等；并可参与细胞生长、增殖和分化，如STAT3、VEGFA 等；部分靶标对细胞信号转导具有调节作用，如MAPK1、MAPK14、MAPK8 等。

图1 复方杜仲健骨颗粒蛋白-蛋白互作网络图Fig 1 PPI network of compound Duzhong Jiangu granule

2.1.3 GO 富集分析结果 以

P

＜0.05 为筛选条件，获得GO 功能富集条目678 个，其中生物过程条目487 条。对以上生物过程进行分析，发现复方杜仲健骨颗粒可能参与的生物学过程可以归为调节炎症反应，对细胞增殖、分化、凋亡的调控，影响血管生成等方面（见表2）。

表2 复方杜仲健骨颗粒作用靶标GO 生物学过程富集
Tab 2 Biological process of GO target enrichment in compound Duzhong Jiangu granule

分类条目名称P 值炎症反应细胞对脂多糖的反应（cellular response to lipopolysaccharide）4.39×10－12脂多糖介导的信号通路（lipopolysaccharide-mediated signaling pathway）1.55×10－9对脂多糖的反应（response to lipopolysaccharide）8.73×10－8炎症反应（inflammatory response）1.73×10－5 NF-κB 转录因子活性的正调节（positive regulation of NF-kappaB transcription factor activity）6.99×10－5 I-κB 激酶/NF-κB 信号的正调节（positive regulation of I-kappaB kinase/NF-kappaB signaling）3.36×10－4细胞因子分泌的正向调节（positive regulation of cytokine secretion）6.88×10－4白三烯生物合成过程（leukotriene biosynthetic process）4.07×10－3对细胞增殖、分化、凋亡的调控凋亡过程的负调控（negative regulation of apoptotic process）1.01×10－10凋亡过程的正向调控（positive regulation of apoptotic process）2.64×10－8无配体的外在凋亡信号通路（extrinsic apoptotic signaling pathway in absence of ligand）6.03×10－8神经元凋亡过程的负调控（negative regulation of neuron apoptotic process）1.85×10－6神经元凋亡过程的正向调节（positive regulation of neuron apoptotic process）5.83×10－6参与凋亡过程的半胱氨酸型内肽酶活性的激活（activation of cysteine-type endopeptidase activity involved in apoptotic process）8.73×10－6凋亡过程（apoptotic process）2.32×10－5神经元凋亡过程（neuron apoptotic process）1.88×10－4内在凋亡信号通路的负调控（negative regulation of intrinsic apoptotic signaling pathway）4.14×10－4响应DNA 损伤的内在凋亡信号通路（intrinsic apoptotic signaling pathway in response to DNA damage） 1.01×10－3响应内质网应激的内在凋亡信号通路（intrinsic apoptotic signaling pathway in response to endoplasmic reticulum stress）1.67×10－2通过死亡域受体的外在凋亡信号通路（extrinsic apoptotic signaling pathway via death domain receptors） 2.43×10－2肿瘤坏死因子产生的负调控（negative regulation of tumor necrosis factor production）2.43×10－2血管生成血管生成的正向调节（positive regulation of angiogenesis）5.29×10－8血管生成（angiogenesis）8.50×10－5血管内皮生长因子受体信号通路（vascular endothelial growth factor receptor signaling pathway）1.78×10－4血管生成的调节（positive regulation of angiogenesis）4.07×10－3

2.1.4 KEGG 富集分析结果 以

P

＜0.05 为筛选条件，对279 个靶蛋白进行KEGG 通路富集，共富集到133 条信号通路。对以上信号通路进行分析、归类，发现复方杜仲健骨颗粒主要影响炎症、软骨细胞增殖、分化、凋亡以及代谢等相关通路过程发挥作用，结果见表3。

表3 复方杜仲健骨颗粒作用靶标KEGG 通路富集
Tab 3 KEGG signal pathway information of compound Duzhong Jiangu granule

分类信号通路名称P 值炎症相关信号通路肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）4.66×10－9 HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）3.25×10－8 Toll 样受体信号通路（Toll-like receptor signaling pathway）1.48×10－7 T 细胞受体信号通路（T cell receptor signaling pathway）4.65×10－5软骨细胞增殖、分化及凋亡相关通路钙信号通路（calcium signaling pathway）6.63×10－8 p53 信号通路（p53 signaling pathway）1.98×10－5 PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathway）3.07×10－5 FoxO 信号通路（FoxO signaling pathway）7.24×10－5 MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）2.30×10－4 NF-κB 信号通路（NF-kappa B signaling pathway）2.30×10－4 Rap1 信号通路（Rap1 signaling pathway）1.21×10－3催产素信号通路（oxytocin signaling pathway）6.84×10－3 Jak-STAT 信号通路（Jak-STAT signaling pathway）1.37×10－2间接相关通路HIF-1 信号通路（HIF-1 signaling pathway）3.25×10－8雌激素信号通路（estrogen signaling pathway）3.12×10－7甲状腺激素信号通路（thyroid hormone signaling pathway）4.97×10－7血管内皮生长因子信号通路（VEGF signaling pathway）1.13×10－6胰岛素抵抗信号通路（insulin resistance signaling pathway）5.29×10－6脂肪细胞因子信号通路（adipocytokine signaling pathway）1.60×10－4

2.2 复方杜仲健骨颗粒部分药理作用及关键靶标验证

为了进一步评价网络药理学结果的可靠性，研究对网络药理学获得的关键药理作用及靶标进行了实验验证。炎症是骨关节疾病中非常重要的致病机制，且在本研究中为关键药理作用。因此本研究选择抗炎活性进行验证。LPS 刺激诱导的RAW 264.7 细胞炎症模型可较好地反映体内局部炎症状态，NO 水平能够反映炎症的严重程度。因此研究通过检测复方杜仲健骨颗粒对LPS 刺激诱导的RAW 264.7 细胞炎症模型的NO 生成抑制作用进而评价其抗炎活性。此外，基于拓扑分析发现TNF、STAT3、MAPK1 是复方杜仲健骨颗粒的关键作用靶标。故研究利用RT-qPCR 对其进行验证。

2.2.1 复方杜仲健骨颗粒细胞毒性研究 不同浓度的复方杜仲健骨颗粒对RAW 264.7 细胞活性的影响结果见图2。结果显示，0.3125 ～2.5 g·L复方杜仲健骨颗粒对细胞无毒性，表明在2.5 g·L以下，复方杜仲健骨颗粒对RAW 264.7 细胞的正常生长无影响。

图2 复方杜仲健骨颗粒对RAW 264.7 细胞存活率的影响Fig 2 Effect of compound Duzhong Jiangu granule on the survival rate of RAW 264.7 cells

2.2.2 复方杜仲健骨颗粒抗炎活性研究 与空白对照组相比，模型组NO 释放量明显增加（

P

＜0.001）。结果提示LPS 能诱导炎症的发生，成功构建了巨噬细胞炎症模型。与模型组相比，复方杜仲健骨颗粒在0.3125 ～2.5 g·L能有效降低NO 的释放（

P

＜0.001），见表4。表明复方杜仲健骨颗粒可以在一定程度上恢复RAW 264.7 的炎性损伤，进一步验证了复方杜仲健骨颗粒的抗炎作用。

表4 复方杜仲健骨颗粒对LPS 诱导的小鼠巨噬细胞释放NO 的抑制作用
Tab 4 Inhibitory effect of compound Duzhong Jiangu granule on NO release induced by LPS

注：与空白对照组比较， ＜0.001；与模型组比较， ＜0.001。
Note：Compared with the blank control group， ＜0.001；compared with the model group， ＜0.001.

组别NO 释放量/（μmol·L－1）抑制率/%空白对照组 1.04±0.05—模型组37.74±0.72*—复方杜仲健骨颗粒0.3125 g·L－1 组 34.42±0.21# 9.03±0.02复方杜仲健骨颗粒0.625 g·L－1 组29.87±0.22#21.43±0.02复方杜仲健骨颗粒1.25 g·L－1 组26.59±0.28#30.38±0.02复方杜仲健骨颗粒2.5 g·L－1 组 7.71±0.15#81.83±0.01

2.2.3 复方杜仲健骨颗粒对

TNF

、

STAT3

、

MAPK1

mRNA 表达的影响 结果显示，与空白对照组相比，模型组

TNF

、

STAT3

、

MAPK1

的mRNA 表达水平上调（

P

＜0.01）；与模型组相比，2.5 g·L的复方杜仲健骨颗粒可使

TNF

、

STAT3

、

MAPK1

的mRNA 表达水平降低（

P

＜0.05，

P

＜0.01 或

P

＜0.001），见图3。

图3 TNF、AKT1 和MAPK1 mRNA 表达水平Fig 3 mRNA expression level of TNF，AKT1，and MAPK1

3 讨论

复方杜仲健骨颗粒在临床上应用广泛，然而其整体作用机制尚不明确。本研究利用网络药理学结合体外实验，初步探讨了复方杜仲健骨颗粒的整体作用机制。

综合拓扑参数、KEGG、GO 富集分析所得到的关键靶标、信号通路、生命过程，构建复方杜仲健骨颗粒“关键靶标-信号通路-生命过程-药理作用”网络，见图4。分析网络药理学结果发现，复方杜仲健骨颗粒具有调节炎症反应、调控细胞增殖、分化及凋亡、影响血管生成等药理作用。

图4 “关键靶标-信号通路-生命过程-药理作用”网络Fig 4 Network of key targets-signaling pathways-biological processes-pharmacological action

目前，复方杜仲健骨颗粒在临床上可用于骨关节疾病的治疗。现代医学研究发现，骨关节疾病的根本原因在于软骨等“关节保护系统”对关节保护能力的丧失。研究表明，软骨细胞和关节组织的其他细胞分泌的促炎因子能够促进软骨基质的降解，进而破坏关节组织代谢平衡并导致骨关节疾病的产生。此外，软骨细胞增殖、分化以及凋亡过程能够影响关节软骨的退化。研究发现，在软骨病变的过程中，血管侵袭作为软骨破坏的始动环节，起到了不容忽视的作用，新生血管可进一步加重软骨结构的破坏，抑制血管侵袭可以阻止骨关节炎的进一步发展。故推测复方杜仲健骨颗粒可能是通过影响骨关节处炎症、软骨细胞增殖、分化以及凋亡及调节血管生成等药理作用，进而发挥治疗骨关节疾病的作用。

为评价网络药理学方法的合理性和准确性，进一步进行了实验验证。首先针对作用突出的抗炎活性进行了体外实验验证。本研究采用LPS 刺激巨噬细胞模拟人体在某些因素的刺激下引起的炎症反应的发生，通过不同浓度梯度的复方杜仲健骨颗粒对LPS 诱导的RAW 264.7 的炎性损伤进行细胞实验。结果表明复方杜仲健骨颗粒可在一定程度上减轻RAW 264.7 的炎症反应，进一步验证了其抗炎作用。

对网络药理学筛选出的部分核心靶标进行RT-qPCR 检测，发现复方杜仲健骨颗粒能够抑制LPS 诱导的RAW 264.7 炎症细胞中

TNF

、

STAT3

和

MAPK1

基因的表达，与PPI 分析结果吻合。在骨关节炎疾病患者中，炎症相关靶标TNF 异常高表达。STAT3 是一种关键调节因子，在炎性反应中发挥着重要的作用。且研究发现，STAT3是骨关节疾病的的核心转录因子，其可通过核因子

κ

B（NF-

κ

B）信号进一步导致骨关节疾病的发生。MAPK1 是MAPK 信号转导通路的重要组成部分，MAPK 信号转导通路则能够负责调节产生促炎细胞因子的过程，该过程最终可导致关节发炎和破坏，由此推断复方杜仲健骨颗粒可能通过抑制

TNF

、

STAT3

和

MAPK1

mRNA 表达发挥抗炎的作用。上述结果在一定程度上从药效以及靶标层面揭示了复方杜仲健骨颗粒发挥作用的分子机制，并佐证了网络药理学结果。

综上所述，本研究为复方杜仲健骨颗粒的整体作用机制解析提供了参考，为其临床应用提供了一定基础。然而本研究仍存在一定不足，首先，本研究聚焦整体作用机制，未聚焦特定疾病，后期可针对特定疾病展开进一步研究。此外，研究仅对复方杜仲健骨颗粒抗炎活性以及部分关键靶标进行了体外验证，未对其他活性和靶标进行体外及体内验证。研究下一步将通过体外或体内实验对复方杜仲健骨颗粒的其他活性和关键靶标进行进一步验证，为其临床应用提供指导。