鱼内脏蛋白水解物的制备及其生理活性研究进展

黄 苹，袁美兰，赵利，江勇，白春清，陈丽丽

（国家淡水鱼加工技术研发分中心（南昌），江西科技师范大学生命科学学院，江西南昌 330013）

2020 年，我国水产品总产量为6549.02 万吨，其中鱼类总产量为2761.36 万吨，在水产品中占比42.2%，同比增长了1.95%。在鱼类加工中，会产生约占生鱼质量40%～55%的副产物（包括鱼头、鱼皮、鱼骨、鱼鳞和内脏），但是约有50%的副产物被直接作为废物丢弃处理，仅有30%被初步加工为低值的动物饲料、肥料或发酵鱼露、鱼粉。其中鱼内脏含有大量的蛋白类物质且在副产物中占有较大比重（约15%～30%），但其难保存、易腐烂及高值化利用程度较低，造成了不必要的浪费和污染。

近年来，从鱼及其副产物中制备蛋白水解物成为研究热点。鱼内脏是蛋白质和omega-3 多不饱和脂肪酸的重要来源，可用作生产蛋白质水解物的原料。鱼蛋白水解物（FPH）是鱼蛋白酶水解后转化成的多肽产物，具有抗凝血、抗菌、抑制血管紧张素转换酶和抗氧化等活性，可以被用于治疗动脉粥样硬化、癌症、冠心病和心血管类疾病。目前，国内外对于鱼内脏生产具有生理活性的蛋白肽的研究较为活跃。例如从大西洋鲭鱼（）内脏的蛋白水解物中纯化抗菌水解物，用沙丁鱼副产物（鱼内脏）、露斯塔野鲮（）内脏、虹鳟鱼内脏、鲤鱼Catla（）内脏制备抗氧化蛋白水解物。但据已有文献可知，鱼内脏蛋白水解物的生物活性尚未像牛奶蛋白肽和植物蛋白肽那样得到广泛深入研究，在临床应用方面也尚未受到关注，目前多数研究还是停留在对制备工艺的不断重复上，只有较少的研究评估了鱼内脏蛋白水解物作为功能性食品的潜在生物活性。

鱼内脏蛋白水解物是生物活性物质，是生产功能食品和营养补充食品的原料来源。本文对目前国内外鱼内脏蛋白水解物的制备工艺和生理活性研究现状进行了综述，并对鱼内脏蛋白水解物的综合加工利用前景进行展望，旨在为鱼内脏蛋白水解物的进一步开发利用提供参考，也为水产品产业的转型发展带来更多机遇。

1 鱼内脏的基本成分构成

鱼内脏可作为生产蛋白质的良好来源，其用途十分广泛，可加工为细菌素、生物降解膜、蛋白胨，还可用作蛋白酶源。作为鱼类加工的主要副产物，鱼内脏约占鱼体质量的10%，其成分比较复杂，主要包括蛋白质、水分、脂肪、灰分等，不同的鱼内脏，其基本营养成分含量有所差异，表1 总结了几种不同鱼内脏的基本成分构成。

表1 不同种类鱼内脏的基本成分构成Table 1 Basic nutritional contents of fish viscera of different species

2 鱼内脏蛋白水解物的制备工艺研究现状

2.1 鱼内脏蛋白水解物的制备工艺步骤

鱼内脏蛋白可以通过酸、碱、酶水解或加热的方法转化为低分子质量肽或游离氨基酸，是提高鱼内脏蛋白生物活性的常见方法。而在水解之前需对样品进行一系列的预处理工艺，以防止蛋白水解液发生氧化、变色及产生臭味和有毒物质。预处理一般包括去除鱼内脏的胆囊、鱼鳔等物质，然后对样品进行绞碎、脱脂、灭酶、过滤、热处理等操作。蛋白水解后获得不同分子量的复杂的小肽段，一般使用超滤或纳滤、微滤、离子交换色谱等方法对肽组分进行初步分离，得到具有多种生理活性的蛋白肽。图1 总结了鱼内脏蛋白水解物的制备工艺步骤。

图1 鱼内脏蛋白水解物制备流程Fig.1 Preparation process of fish viscera protein hydrolysate

2.2 鱼内脏蛋白水解物的制备方法

蛋白水解物的制备方法分为化学法（包括酸水解、碱水解和热水解）和生物法（包括自溶、微生物发酵和酶解法）。化学法适用于非特定性的水解，其主要优势是操作简单且成本低廉，因此在工业上的应用较为广泛，但反应过程难以控制，且会导致营养物质的损失和水解产物的生物活性较低。酶解法由于具有条件温和、易于控制、无副作用且产物营养价值较高等优点，因此，是接受程度最高、最适合用于生产FPH 的方法。

近年来，越来越多的学者采用酶法水解鱼内脏蛋白制备活性肽。表2 详细总结了国内外不同鱼内脏制备蛋白水解物的工艺条件及部分产物的生理活性。在国内，孙一玮等以复合酶酶解鳕鱼内脏得到氨基酸含量为16.33 mg/mL 的鱼内脏蛋白水解物。林慧敏等以脱脂鮟鱇鱼肝为原料制备的抗氧化肽，水解度为69.52%，羟自由基清除能力76.74%。褚晨艳等用胰蛋白酶对草鱼内脏进行水解，通过单因素实验和正交试验优化水解条件，最佳条件下水解度可达37.87%。李致瑜等用Alcalase 蛋白酶酶解大黄鱼内脏制备抗氧化肽，在最佳工艺下此内脏多肽具有较高的抗氧化活性，水解度为30.66%。在国外，Gómez 等确定了罗非鱼内脏制备蛋白水解物的最佳酶解时间、温度以及pH 等工艺条件，水解度为42.5%。Motamedzadegan 等用中性蛋白酶水解黄鳍金枪鱼内脏，其水解度相较其他酶制备蛋白水解物，水解度较低为30%。以上研究都以水解度为指标，确定了不同鱼内脏的水解条件，从中可知，不同条件下的水解度是不同的，这取决于所选择的酶、底物以及温度、酸碱度、酶解时间等，其中蛋白酶的特异性影响分子量和疏水性，可以用来系统地从N 末端或C 末端清除氨基酸，从而影响蛋白质的水解。较长的水解时间产生分子量较小的蛋白质和肽，在蛋白质表面产生更多暴露的可电离和极性基团，使其与水形成氢键的能力提高，则溶解性高，具有较高水解度。温度和酸碱度都会对酶的反应动力学产生很大影响，极端的温度和酸碱度会使酶变性而失活，从而导致水解程度降低。研究发现，一般碱性条件下的底物蛋白和水解物蛋白的可溶性肽含量高于酸性条件下的可溶性肽含量；pH 接近中性的酶，如中性蛋白酶、碱性蛋白酶和风味酶应用更加广泛。综合文献来看，使用碱性蛋白酶、延长酶解时间及在中性或碱性条件下，鱼内脏蛋白水解物的水解度更高，且大多数小分子肽段具有更高的抗氧化活性，从而提高鱼内脏蛋白水解物的生理活性。此外，酶解法受多种因素的调控，它对环境污染较小，是目前具有发展前景的一种技术。

表2 鱼内脏水解制备蛋白肽的工艺Table 2 Preparation of protein peptides from fish viscera by hydrolysis

从表2 可以看出，鱼内脏蛋白水解物的相关研究比较多，虽然它们有潜在的生理功效，但大多数关于鱼内脏蛋白水解生物活性的实验都是在体外进行的，尚未进行体内研究和临床证实，导致其工业化制备和应用也尚未实现。如果能进一步完善相关研究，并充分开发利用其生理活性物质，则可为淡水鱼加工副产物的合理利用提供方向，提高水产行业的经济效益。

3 鱼内脏蛋白肽的氨基酸组成

蛋白及多肽的理化特性和生理活性与它的氨基酸组成有着直接或间接的关系。表3 总结了部分鱼内脏蛋白肽的氨基酸组成。可以看出因鱼类种类不同，氨基酸组成有较大差异，且同一种鱼内脏，不同水解处理条件得到的内脏蛋白水解物的氨基酸组成也是不一样的。其中大多数鱼内脏含有较高的谷氨酸、甘氨酸、精氨酸、脯氨酸、亮氨酸。

表3 鱼内脏蛋白酶解物中活性肽的氨基酸序列Table 3 Amino acid sequences of active peptides in the hydrolysates of fish viscera

4 鱼内脏蛋白水解物的生理活性研究

4.1 鱼内脏蛋白的抗氧化性

自由基是通过身体内的正常生理反应产生的物质，但过量的自由基生成易导致机体细胞或组织损伤。天然蛋白水解物在抑制氧化和清除自由基方面起着重要作用，可防止衰老、抗高血压、抗癌症、心血管疾病等慢性病，增强机体免疫力。

目前，研究表明鱼类加工副产物的蛋白水解物是潜在的食品抗氧化剂的天然来源，许多抗氧化肽已在鱼内脏蛋白水解物中被鉴定出来。Ganesh 等用胃蛋白酶和胰蛋白酶复合水解乌鲳鱼内脏，经分离纯化得到分子量为701.9 Da，结构为Ala-Met-Thr-Gly-Leu-Glu-Ala 的高抗氧化性肽段，在1 mg/mL 浓度下，DPPH 达到54%、金属螯合能力达到78.6%，随着酶解液浓度的增加，还原力也加强。Hassan等研究了用化学法和酶法制备得到的鲢鱼内脏蛋白水解液的喷雾干燥产物的抗氧化性能。结果表明，胃蛋白酶和木瓜蛋白酶制备的鲢鱼内脏蛋白水解液具有良好的抗氧化性能和综合品质。Je 等用不同蛋白酶对金枪鱼肝脏进行酶解得到的蛋白水解物，其还原力、DPPH 清除能力等都较高，具有较好的抗氧化活性。李娜等对鳕鱼鱼鳔用六种酶进行酶解，其产物DPPH 清除能力达到61.1%，同时有较好的亚铁离子螯合能力。Bougatef 等对沙丁鱼内脏蛋白水解产物中的新型抗氧化肽进行纯化与鉴定，分离出七个抗氧化剂肽，其结构分别为Leu-His-Tyr、Leu-Ala-Arg-Leu、Gly-Gly-Glu、Gly-Ala-His、Gly-Ala-Trp-Ala、Pro-His-Tyr-Leu 和Gly-Ala -Leu-Ala-Ala-His，第一个肽表现出最高的DPPH 自由基清除活性，达63%±1.57%。研究表明，低分子量的肽段抗氧化活性更高。

4.2 鱼内脏蛋白水解物的抑制血管紧张素I 转化酶（ACE）活性

人体肾素-血管紧张素生化系统（RAS）和激肽释放酶-激酶系统（KKS）对人体内的血压进行调节。RAS 是升压调节系统，肾素先将血管紧张素原转化为血管紧张素I，再通过血管紧张素转换酶（ACE）转化为血管紧张素II，导致血压升高（高血压）。KKS能使毛细血管舒张，增加通透性，使血压下降，是降压调节。ACE 抑制剂作用于抗高血压治疗靶点，对于高血压人群，如果服用ACE 抑制剂，则降低血管紧张素Ⅱ的生成，血压下降，从而达到治疗高血压的目的。杨晓军等以斑点叉尾鮰内脏为原料，用木瓜蛋白酶进行水解，制备血管紧张素转化酶抑制产物，酶解产物的ACE 抑制率为72.34%。Bougatef等研究了不同蛋白酶处理的沙丁鱼副产物（鱼头和鱼内脏）所制的蛋白水解物的血管紧张素转换酶抑制活性，结果表明所有水解产物对血管紧张素转换酶都有抑制活性，而碱性蛋白酶处理内脏产生的水解产物具有最高的抑制活性（63.2%±1.5%）。Je 等使用不同的酶对金枪鱼肝进行水解，结果表明所有水解产物都具有ACE 抑制特性。目前，大多数具有ACE 抑制活性的蛋白肽都是化学合成的，具有一定的副作用，因此，制备天然的具有ACE 抑制活性的蛋白水解物是值得研究的热点。

4.3 抗菌性

抗菌肽（AMPs）是由10～60 个氨基酸组成的具有生物活性的小分子多肽，已发现植物、动物和微生物等多种来源。其中鱼蛋白水解物中的抗菌肽，不仅能消除入侵的微生物，还能够调节炎症反应。LEAP-2和Hepcidins（铁调素）都是由鱼肝脏合成的抗菌多肽。有报道指出鱼蛋白水解物对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌都有一定的抑制作用。目前用鱼内脏提取抗菌肽的研究相对较少，Pezeshk 等用鱼精蛋白复合酶对黄鳍金枪鱼内脏进行水解，获得的水解物通过超滤分离得到四个不同分子量的肽段，其中，最低分子量即<3 kDa 的抗菌肽段对革兰氏阳性（李斯特菌和葡萄球菌）和革兰氏阴性（大肠杆菌和假单胞菌）致病菌和与鱼腐败相关的微生物具有最高的抑菌率，对DPPH和ABTS自由基具有清除活性，且铁离子还原能力较强。这些结果表明，从黄鳍金枪鱼内脏中提取的蛋白质水解产物及其肽段可用作营养制品和功能性食品中的抗菌成分和抗氧化成分。

Ennaas 等使用复合蛋白酶水解鲭鱼（）内脏，获得的水解物对革兰氏阳性菌（）和革兰氏阴性菌均有抑制作用。Robert等用复合蛋白酶将罗非鱼内脏水解，水解产物的必需氨基酸含量较高，且氨基酸组成平衡，并对鲁氏耶尔森菌（）、爱德华氏菌（）和巨大芽孢杆菌（）有明显抗菌作用。

抗菌肽除可直接杀灭微生物外，还可通过免疫调节机制改善其免疫功能，增强抗病能力，具有无污染、无残留、广谱抗菌及不易产生耐药性等特点，是水产动物自身免疫系统的重要组成部分，已成为国内外学者研究的热点，有望成为制药领域新抗生素以及食品工业中抗菌剂的潜在替代物。

4.4 鱼内脏蛋白水解物的其他生理活性

据报道鱼副产物蛋白水解物具有抗压、预防糖尿病、抗衰老、抗炎和抗癌等潜在活性，且在制药领域已有应用，例如鱼骨具有降血糖作用；罗非鱼皮对细胞生长具有保护作用、对抗衰老具有好的发展潜力。目前，有少量关于利用鱼的消化酶生产生物活性肽的报道。Gómez 等在罗非鱼内脏的水解产物研究中，用HO应激的人肠分化Caco-2 细胞评价水解产物对氧化应激的保护作用，得到的两个馏分RTVH-A 和FRTVH-V，在≤0.5 mg/mL 的浓度下，可防止细胞活力的降低，并抑制HO诱导的细胞内活性氧（ROS）的积累，表明RTVH-A 和FRTVH-V 是具有抗氧化特性的成分，并且对ROS介导的肠损伤具有保护作用。Giannetto 等从鳀鱼内脏中获得的蛋白质水解物（APH）对脂多糖诱导的RAW 264.7 细胞炎症有显著的保护作用，降低了促炎介质（即环氧化酶-2）的蛋白表达。同时对敲除基因的小鼠饮食中补充APH，发现其对主动脉和心脏组织中的促炎细胞因子及氧化应激相关基因（/、、、和）的表达进行调节，表明APH 可发挥有益作用，具有抗炎性。Xu 等对鮟鱇鱼肝脏进行水解得到鱼内脏蛋白肽，再利用实验小鼠爬升耐力试验证明了该蛋白肽是一种抗疲劳肽，有明显的抗疲劳作用。现有的研究表明鱼内脏蛋白水解物具有一定的疾病预防和治疗作用，具有潜在的应用价值，但距离实际应用还有很长的一段路要走，需要围绕制备工艺条件、活性成分作用机制等方面进行更广泛和深入的基础研究。

5 展望

目前国内外对鱼内脏的研究比较多，但这些研究还停留在较低水平的重复上，且基本上都还处于实验室研究阶段，深度研究和高值化综合利用较少。鱼内脏蛋白水解物具有抗氧化、ACE 抑制、免疫调节、金属离子螯合、抑菌、抗糖尿病等多种生理活性，如何进一步提高水解产物的生理活性，并加快对其生理活性的体内和体外实验研究，使之尽早用于营养保健品或功能性食品的生产开发，尽快走上产业化的道路是值得期待的。

蛋白水解物的生物活性与其氨基酸组成和序列有关，大多数具有免疫调节和抗癌活性的食源性蛋白水解物的活性都是通过细胞培养和动物模型进行测试的，仅有少数涉及临床实验。另一方面，利用鱼内脏蛋白水解物制备功能性食品还未见报道，大多是加入到鱼饲料，还需要进一步研究其在食品基质中的性能和稳定性。

此外，FVPH 的生产和使用，正成为一种受欢迎的可持续替代物，如天然抗氧化剂、蛋白质补充剂、饮料中的稳定剂和糖果产品中的风味增强剂等，但在原料和产品质量保证、低成本工艺的开发以及活性成分的分离和剩余组分回收方面存在挑战。另外，鱼内脏蛋白水解工艺若控制不当，可能会产生苦味，从而影响食品基质的感官特性，因此，如何控制水解工艺条件以避免产生苦味，以及对蛋白水解物进行有效的脱苦脱臭是值得研究的。