基于网络药理学探讨重楼与非小细胞肺癌相关分子机制

陈佳丽 滕龙飞 李素云 范正媛

(1 河南中医药大学,郑州，450046; 2 河南中医药大学第一附属医院,郑州，450000)

原发性支气管肺癌(Primary Bronchogenic Carcinoma)简称肺癌。按组织病理学特点不同，分为小细胞肺癌(Small Cell Lung Cancer,SCLC)和非小细胞肺癌(Non-small Cell Lung Cancer,NSCLC)两大类，而NSCLC占全部肺癌的80%左右。据全球癌症统计数据报告，肺癌发病率高达11.6%，居癌症首位[1]。调查显示，85%以上肺癌患者有吸烟史，我国是烟草消费大国，肺癌防治已成为我国重要公共健康问题。西医治疗肺癌的方法包括手术、放疗、化疗、靶向以及免疫治疗，而这些方法存在一定局限性，或容易复发，或不良反应较大，或易产生耐药性等[2]。因此寻找疗效好、不良反应小的药物是当务之急。

中药由于其毒性较低、作用持久的优点，在治疗癌症方面展现了独特的优势，是开发抗癌新药的重要来源。肺癌在中医古籍中有息贲、肺积、癥瘕、积聚、咳嗽等的记载，《灵枢》曰：“虚邪之人……寒与热相搏，久留而内著，邪气居其间而不反，发为瘤。”《灵枢》曰：“夫血脉营卫，周流不休……寒邪客于经络之中则血泣，血泣则不通……故痈肿。寒气化为热，热胜则肉腐……血枯空虚，则筋骨肌肉不相荣，经脉败漏，熏于五脏，脏伤故死矣。”肺癌发病，多由痰、虚、毒、瘀等病因导致，正气虚损，脏腑功能失调，正虚而邪入，使气血周行不利、产生瘀积，互结于肺，因此气血因寒瘀滞，郁而化热是肿瘤与痈的共同病机，治宜散结消瘀之法[3]。从药理学方面积累的证据表明，散结消瘀法可以改善肺癌患者的症状，预防疾病进展，且常规治疗联合散结消瘀类方药效果优于单纯西医治疗[4]。

重楼[Parispolyphyllavar.yunnanensis(Franch.)Hand.-Mazz.]具有清热解毒，消肿止痛，平喘止咳之功效，可散结消瘀，是临床治疗肺癌高频中药之一[5]。现代药理学研究结果表明，重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ对多种癌细胞生长均具有抑制作用[6-10]。重楼作为临床广泛应用的一味中药，具有多靶点、价格低、增效减毒等优点，同时也面临着成分较多、作用机制不明确等问题。随着计算机技术及生物数据库的网络药理学的出现，使探索中药发挥作用的物质基础和潜在作用机制变为可能。这种研究方法，与中医药的整体观不谋而合，有利于阐明中药起作用的科学依据。本文采用网络药理学方法，建立“成分-靶标-通路”网络，利用现代生物信息手段探讨重楼治疗NSCLC的可能作用机制，为深入研究重楼和研发新型治疗NSCLC药物提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 获取药物活性成分和靶基因 在中药与化学成分数据库(http://www.organchem.csdb.cn/scdb/main/tcm_introduce.asp)以“重楼”或“蚤休”为关键词，检索获得其化学成分，以SMILES格式保存。利用瑞士生物信息研究所(Swiss Institute of Bioinformatics，SIB)平台(http://www.swissadme.ch/)限定药物动力学参数(Absorption为High)，筛选重楼主要活性成分，并根据文献报道筛选不符合药物动力学参数但有可能起到治疗作用的药物成分，并利用SwissTargetPrediction在平台中获得其所对应的靶标[11-12]。

1.2 NSCLC相关靶标基因的获取 在人类基因组注释数据库GeneCards数据库(https://www.genecards.org/)中以“Non-small cell lung cancer”为关键词，检索与NSCLC相关靶标基因[13]。

1.3 重楼治疗NSCLC潜在作用靶点预测 通过Venny2.1绘图工具，将重楼主要活性成分对应的靶基因与疾病靶基因相映射，获得“重楼”治疗NSCLC的关键作用靶基因。

1.4 成分-靶点网络的构建与分析 利用Cytoscape(Version 3.6.1)构建“成分-靶点”网络。在网络中，节点(Node)代表重楼活性成分、关键靶基因。边(Edge)代表活性成分与靶基因相互作用关系。

1.5 核心靶点相互作用网络构建与分析 为明确潜在作用靶点之间的相互作用关系，将1.3筛选出的共同靶点导入STRING数据平台，将蛋白种类定义为“Homo sapiens”，设置信度>0.7为筛选条件，构建蛋白质-蛋白质相互作用(Protein-protein Interaction，PPI)网络，将“重楼”与NSCLC相关的85个靶蛋白导入String数据库中，获取其相互作用关系的信息，利用Cytoscape 3.6.1软件可视化，以TSV格式文件保存。将其导入Cytoscape-3.6.1中，并运用其插件“Network Analyze”分析网络拓扑参数，以节点度值越大说明其越重要[14]。

1.6 基因富集分析及其可视化 将“重楼”与NSCLC的共同基因导入功能注释生物信息学分析平台(DAVID)数据库[15](https://david.ncifcrf.gov/)，进行基因本体(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析。筛选P<0.05的通路，选取富集基因数最多的前20条通路，使用bioinformatics网站(http://www.bioinformatics.com.cn/)绘制高级气泡图。利用DAVID6.8数据库，将19个关键靶点进行GO、KEGG富集分析，以P<0.05为前提筛选GO功能和KEGG通路，并制作高级气泡图。

1.7 成分-靶点-通路网络构建 选取富集基因数最多的20条通路，结合文献检索，筛选出可能与治疗NSCLC相关的通路，利用Cytoscape 3.6.1构建出“成分-靶点-通路”网络关系图。

1.8 分子对接 将重楼核心成分β-蜕皮素通过Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)下载其“3D SDF”格式文件，作为分子对接配体；将NSCLC通路涉及核心靶点PIK3CA、MAPK3、MAPK1通过PDB数据库，下载其“PDB”格式文件，作为分子对接受体，利用PyMOL软件去水加氢后将受体及配体保存成“pdbqt”格式文件，利用Autodock Vina进行分子对接，筛选结合能绝对值最高的为最优结构。

2 结果

2.1 重楼活性成分与相应靶点 以药物动力学参数(Absorption为High)作为限定条件并参考文献报道，筛选出活性成分9个，重楼成分共有14个。见表1。同时在平台获取重楼主要活性成分的预测靶点，共200个。

表1 重楼活性成分

2.2 NSCLC潜在靶点的预测 通过GenCards、OMIM数据库剔除重复后共收集NSCLC潜在靶点4 351个。

2.3 重楼治疗NSCLC潜在作用靶点 将重楼和NSCLC潜在靶点进行映射取交集共得到85个交集靶点，即重楼治疗NSCLC潜在作用靶点。见图1。

图1 重楼和NSCLC靶点韦恩图

2.4 构建“药物-活性成分-靶点”网络 此网络共包括节点150个，边202条；节点(Node)代表重楼、重楼活性成分、重楼治疗NSCLC潜在作用靶点；边(Edge)代表其相互作用关系。其中，β-蜕皮素、γ-氨基丁酸、重楼皂苷A、重楼皂苷G、重楼皂苷F、重楼皂苷D、重楼皂苷B涉及核心靶点较多，可能是重楼治疗NSCLC的关键成分，根据“Degree”值大于均值2.73的关键靶点包括HSD11B2、PPP2R5A、PPP1CC、PTAFR、STAT3、IL2、PTPN1、PPP2CA、PPM1B、HSD11B1、HPSE、FGF1、VEGFA、F2、BCL2L1、ABAT，这些靶蛋白在网络中具有一定的重要性。见图2。

图2 重楼-活性成分-靶点网络

2.5 PPI网络的构建 PPI网络图中共涉及85个节点、273条边，其中节点越大度值越大，其关系越密切，其在网络中更重要。Degree值排名前5位的靶蛋白为促分裂原活化的蛋白激酶1(MAPK1)、信号转导及转录激活因子3(STAT3)、促分裂原活化的蛋白激酶3(MAPK3)、磷脂酰肌醇-3-激酶催化亚基α(PI3KCA)、血管内皮生长因子A(VEGFA)。见图3。

图3 重楼核心靶蛋白PPI网络

2.6 GO、KEGG富集分析 通过GO功能富集分析可知，富集基因数量排名前10位的相关生物过程包括多细胞生物生长的调节、积极调控细胞增殖、细胞分裂的正调控、内皮细胞迁移的正调控、缺乏配体的外在凋亡信号通路、端粒封端的正调控、端粒酶活性的正调控、通过端粒酶积极调节端粒的维持、对表皮生长因子的反应、肺形态发生。见图4A。NSCLC的发生涉及多种生物过程，而重楼可以通过对以上多种生物过程的调节，治疗NSCLC。KEGG通路富集分析可知，重楼治疗NSCLC的靶点主要与PI3K-AKT信号通路、蛋白聚糖在癌症通路、Ras信号通路、HIF-1信号通路、Rap1信号通路、VEGF信号通路、T细胞受体信号通路、FoxO信号通路、NSCLC通路等关系较为密切。重楼可能通过多通路共同起到治疗NSCLC的作用。见图4B。

图4 重楼作用靶点的富集分析

2.7 构建“成分-靶点-通路”网络 此网络共有节点32个，边线93条，体现了重楼治疗NSCLC的过程涉及多成分-靶点-通路，符合中药作用机制复杂多样的特点。其中，PI3K-AKT信号通路Degree值最高，涉及核心靶点最多，如核心靶点PIK3CA、MAPK3、MAPK1、VEGFA等；NSCLC通路涉及核心靶点PI3KCA、MAPK3、MAPK1。见图5。

图5 “成分-靶点-通路”网络

2.8 分子对接以验证预测 结果显示：β-蜕皮素与PIK3CA结合能值为-9.5 kcal/mol(1 cal=4.184 J)，与MAPK3结合能为-8.4 kcal/mol，与MAPK1结合能为-7.0 kcal/mol，分子对接模式见图6，重楼的活性成分和关键靶蛋白的结合能力较好，初步验证了预测结果的可靠性。

图6 分子对接

3 讨论

网络药理学作为一种新型研究方法，利用网络、数据库、计算机综合分析药物的作用机制，契合中医的整体观思想，已经被成功用于中药的研究中。本研究利用多个数据库，获得了重楼治疗NSCLC的85个候选靶点，根据筛选出大于“Degree”均值的关键靶点，分别为HSD11B2、PPP2R5A、PPP1CC、PTAFR、STAT3、IL2、PTPN1、PPP2CA、PPM1B、HSD11B1、HPSE、FGF1、VEGFA、F2、BCL2L1、ABAT。由于PPI关系，为了进一步扩大筛选范围，故基于候选靶点构建PPI蛋白网络。根据网络拓扑参数筛选出5个关键靶点，分别为MAPK1、STAT3、MAPK3、PI3KCA、VEGFA。最终去除重复后获得重楼治疗NSCLC的19个靶点，这些靶点被认为可能是重楼在NSCLC病理过程中发挥治疗作用的关键靶点。

GO功能富集分析可知，富集基因涉及细胞生长、增殖、分裂、迁移、凋亡过程以及维持端粒稳定。KEGG通路富集分析可知，核心靶点MAPK1、MAPK3、PI3KCA均富集在NSCLC通路，核心靶点MAPK1、MAPK3、VEGFA、PIK3CA、BCL2L1、FGF1、STAT3均富集在癌症通路。核心通路PI3K-AKT信号通路是近年癌症研究的焦点之一，在细胞增殖、细胞周期改变等方面有着关键作用。研究显示，微RNA可通过下调PI3K-AKT信号通路的信号转导，阻滞细胞周期，达到抑制肺癌细胞的侵袭、转移[16-17]。FoxO信号通路中抑癌因子FOXO3a可拮抗PI3K-AKT生存信号，修复细胞DNA损伤[18]；相关研究表明，大部分肺鳞癌患者存在着FOXO3基因缺失导致FoxO信号通路的异常[19]。在NSCLC组织中，MAPK信号通路的磷酸化p38 MAPK和磷酸化ERK1/2的表达均升高，其与肺癌的发生、预后密切相关[20]。故重楼可能通过与多靶点、多通路之间的共同协同作用，达到治疗NSCLC的效果。

重楼是我们导师治疗NSCLC的常用药，其功效为清热解毒，消肿止痛，活血化瘀，止咳平喘，现代药理发现重楼有止血止痛、祛痰抑菌、抗细胞毒的作用，与肺癌“痰、毒、瘀”的病理特点相切合[21]。研究证实，重楼治疗NSCLC疗效确切，探讨其活性成分及作用机制有一定意义，其所含的β-蜕皮素、γ-氨基丁酸、重楼皂苷A、重楼皂苷G、重楼皂苷F、重楼皂苷D、重楼皂苷B均具有较高的Degree值，是重楼重要活性成分，与核心靶标和通路联系密切，其具有抗肿瘤、细胞毒，免疫调节等作用[22-23]。重楼皂苷A可能通过P53/GADD45/JUN信号通路，抑制蛋白激酶B蛋白磷酸化诱导NSCLC细胞凋亡[24]；重楼皂苷G通过蛋白激酶B、P38促分裂原活化的蛋白激酶和Jun激酶诱导细胞凋亡和自噬来抑制癌细胞成活[25]；重楼皂苷F和重楼皂苷G通过阻断G2/M细胞周期诱导细胞凋亡，在体内外均明显抑制肺癌细胞生长[26]；重楼皂苷D可能通过降低基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9表达，抑制肺癌细胞侵袭、转移发挥抗癌作用[27]；香烟有害物诱导小气道肺腺癌动物中γ-氨基丁酸表达不足，提示γ-氨基丁酸可能具有抗小气道肺腺癌作用[28]；重楼皂苷B可能通过PI3K/AKT/mTOR信号通路降低基质金属蛋白酶-1、基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9基因表达抑制肺癌细胞侵袭、转移[29]。β-蜕皮素尚未见抗癌机制报道，其口服生物利用度高，在网络中也是重点成分之一，可做进一步研究。

综上所述，本研究初步预测了重楼治疗NSCLC的可能靶点及相关机制，为进一步实验研究提供参考。重楼治疗NSCLC的有效成分可能是β-蜕皮素、γ-氨基丁酸、重楼皂苷A、重楼皂苷G、重楼皂苷F、重楼皂苷D、重楼皂苷B等，这些成分可能通过MAPK1、MAPK3、VEGFA、PIK3CA、BCL2L1、FGF1、STAT3等多靶标-多通路，共同参与抗肿瘤、免疫调节、维持端粒稳定作用。本研究利用网络药理学方法初步探讨重楼治疗NSCLC的作用机制，但仍具有一定局限性，有待进一步探讨及实验验证。