漆酶的固定化技术及固定化漆酶载体材料研究进展

杨月珠，李章良，吕源财，张明静

(1.福州大学环境与安全工程学院，福建福州 350108；2.莆田学院环境与生物工程学院，福建莆田 351100；3.福建省新型污染物生态毒理效应与控制重点实验室，福建莆田 351100；4.生态环境及其信息图谱福建省高等学校重点实验室，福建莆田 351100)

漆酶是一种含铜的多酚氧化酶，也称为对苯二酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶。漆酶可催化降解多种难降解的有机污染物，如酚类污染物[1-2]、多环芳烃[3]、多氯联苯[4]、染料[5]、木质素[6]、内分泌干扰物[7]及其他有机化合物，并且发生反应后唯一的产物就是水，因此，它是一种绿色环保的催化剂。漆酶具有催化底物范围广、催化效率高、贮存要求低且氧化底物不产生二次污染等优点，自漆酶发现以来，其研究一直是国内外学者研究的热点[8]。

漆酶来源广泛，可存在于不同种类的细菌、真菌、昆虫和植物中[9]。按来源可分为植物漆酶、动物漆酶、微生物漆酶，其中微生物漆酶又可分为真菌漆酶和细菌漆酶[8,10]。游离漆酶易受环境影响，导致变性失活、生产成本高、重复利用率低等缺陷，限制了其应用，由此提出了漆酶固定化技术。漆酶固定化技术通过物理或化学的方法将游离漆酶和相应载体材料结合起来，从而增强漆酶的活性，同时达到重复利用以及降低成本的目的。与游离漆酶相比，固定化漆酶后可以避免以上缺陷，达到可回收重复利用的效果。漆酶固定化技术的两大关键是漆酶的固定化技术和固定化漆酶载体材料，而载体材料的性能更是直接影响固定化漆酶的催化活性[11]。近年来，由于漆酶固定化技术领域的快速发展，越来越多高效的固定化载体材料被研究发现，推动了漆酶在各个领域的应用。

本文根据国内外的最新研究进展，介绍了漆酶的结构特征和催化特性，总结了漆酶的固定化技术和固定化漆酶载体材料的研究进展，指出了漆酶固定化技术和载体材料目前存在的问题和未来的发展前景，旨在为进一步对固定化漆酶的研究和开发应用提供参考依据。

1 漆酶的结构特征和催化特性

漆酶是一种糖蛋白，由肽链、糖配基、Cu2+3个部分组成，其中，Cu2+是漆酶最重要的组成部分。一般漆酶含有4个Cu2+，根据光谱学和磁学性能可以将Cu2+分为以下3类：Ⅰ型Cu2+(T1-Cu)是单核中心，呈顺磁性，其与两个组氨酸(His)的N和一个半胱氨酸(Cys)的S配位，610 nm处有蓝色吸收带；Ⅱ型Cu2+(T2-Cu)和Ⅲ型Cu2+(T3-Cu)构成三核中心，是漆酶的催化活性中心，其中T2-Cu也呈顺磁性，但是无特殊吸收光谱；T3-Cu由两个Cu2+组成，由于其偶联作用，具有抗磁性，但是在330 nm附近有较宽的吸收带[12-13]。

漆酶的催化机理是利用Cu2+的氧化还原能力将底物氧化，并将第二底物的氧气还原成水，这一过程可分为以下3个部分：漆酶分子氧化底物、电子转移以及分子氧还原成水[14]。首先，还原性底物被载体材料吸附到漆酶分子附近，被T1-Cu氧化释放出电子；其次，T1-Cu通过Cys-His途径将电子传递给由T2-Cu和T3-Cu组成的三核中心上；最后，分子氧接受电子后被还原成水[10]。

2 漆酶的固定化技术

漆酶的固定化技术有物理方法和化学方法两大类，物理方法包括吸附法、包埋法等；化学方法包括共价结合法、交联法。

2.1 吸附法

吸附法是利用各种吸附载体材料通过分子间作用力(如范德华力、离子键合、氢键、静电作用等)将漆酶吸附在其表面上而使酶固定的一种方法[15-16]。吸附法是最简单、方便的方法，并且其对漆酶活性损失较小，但漆酶与吸附载体之间的结合力较弱，会造成漆酶从载体上解吸，导致漆酶的固定化效率较低。根据漆酶和吸附载体之间结合力的不同，其又分为物理吸附法和离子吸附法。

2.1.1 物理吸附法

物理吸附法是将漆酶与活泼吸附载体材料接触，通过分子间的作用力使漆酶吸附在载体材料上的固定化方法[17]。在该法固定漆酶的研究过程中，常用的固定化载体有高岭石、金属有机框架(MOF)材料、分子筛、多孔玻璃等有机或无机多孔材料。例如，研究者将漆酶通过物理吸附固定在介孔拉瓦希尔骨架系列材料(MIL)-53(Al)骨架上，固定化漆酶具有较高的活性回收率和稳定性，尽管漆酶活性略有下降，但通过固定化漆酶对三氯生的高去除率表明介孔MIL-53(Al)的吸附和漆酶的催化降解之间存在完美的协同作用[18]。图1展示了将漆酶通过物理吸附固定在高岭石上，研究发现，在最佳固定化条件下，固定化漆酶负载效率为88.22%，负载量为12.25 mg/g，最高活性为839.01 U(酶活力单位)/g[19]。除了上述载体外，碳纳米材料由于其比表面积大也成为物理吸附法中常用的载体。

图1 高岭石固定漆酶的过程[19]Fig.1 Process of Laccase Immobilized on Kaolinite[19]

2.1.2 离子吸附法

离子吸附是利用漆酶与含有离子交换基团的不溶性载体之间通过静电作用力结合的一种固定化方法，其常用载体有阴离子交换剂和阳离子交换剂[20]。如图2所示，研究者利用Fe3O4@C-Cu2+纳米粒子吸附和固定漆酶，发现固定化漆酶具有较高的负载能力、漆酶活性以及稳定性和重复使用性[21]。还有研究者采用离子吸附法将漆酶可逆地固定在金属离子螯合磁性微球上，与游离漆酶相比，固定化漆酶的热稳定性和操作稳定性都显著提高[22]。

图2 漆酶固定在羟基和羧基功能化Fe3O4@C纳米粒子的制备工艺[21]Fig.2 Preparation Process of Hydroxyl and Carboxyl Functionalized Fe3O4@C Nanoparticles for Laccase Immobilization[21]

2.2 包埋法

包埋法根据不同载体可分为凝胶包埋法和微囊化包埋法。凝胶包埋法是指将漆酶包裹在凝胶形成的网格中，该方法操作简单，反应条件温和以及机械稳定性较高。但在固定过程中存在漆酶泄露和孔隙扩散阻力等缺陷。在包埋法中常用的载体材料包括藻酸盐、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺等，其中藻酸盐因为其优异的凝胶特性成为了最常用的载体材料之一。例如，研究者将漆酶包埋在海藻酸钙珠粒上用于不同合成染料的脱色，结果发现在连续几个批次后，固定化漆酶对纺织染料表现出高效脱色[23]。

微囊化包埋法是通过物理或化学方法将酶包裹在膜装置(如中空纤维或微胶囊)中的一种固定化方法，可以同时固定多种酶[24]。该法一般操作简单，可以最好地维持漆酶的自身结构并且长期稳定，是一种经济有效的方法。Dai等[25]采用乳液静电纺丝法制备了多壁碳纳米管(MWCNTs)改性的静电纺丝纤维膜固定化漆酶(MWCNTs-LCEFMs)，并将漆酶和MWCNTs包裹到纤维中。研究发现，MWCNTs-LCEFMs的活性回收率为85.3%，比表面积和拉伸强度提高了2～3倍，且其对环境因素的耐受力也有所提升。虽然微囊化包埋法具有操作简单等优点，但也存在漆酶浓度较低、负载量较低、孔径限制等常见缺点。

2.3 共价结合法

共价结合是酶的侧链氨基酸如赖氨酸、Cys或天冬氨酸与载体表面基团发生化学反应形成共价键，通过共价键结合的方式达到固定化效果的一种固定化方法，氨基、羧基或巯基等官能团有利于共价键的形成[26]。例如，利用共价键将漆酶固定在改性聚酰亚胺气凝胶上，结果发现固定化漆酶的稳定性显著提高，并且在重复使用测试中，固定化漆酶在7次循环后仍保持22%的初始活性[27]。还有文献报道指出，将漆酶通过共价键固定在改性氧化石墨烯(GO)磁性纳米粒子上，发现与游离漆酶相比，固定化漆酶的储存、酸碱度和热稳定性都得到了提高[28]。

在该方法中酶和载体之间结合力强，不存在酶泄露和解吸的问题，但其缺陷也较为明显，例如准备过程较为复杂、固定化条件艰难，同时在固定过程会伴随着漆酶活性丧失等问题。

2.4 交联法

交联法是通过功能团试剂与漆酶分子之间形成的共价键作用而得到稳定酶分子来固定化酶的一种方法。常用的交联试剂有戊二醛、己二胺、顺丁烯二酸酐等，其中最常用的是戊二醛。Ren等[29]采用有机肥为载体，戊二醛为交联剂对漆酶进行固定化，探究了漆酶固定化的最佳条件，并研究了游离漆酶和固定化漆酶的最佳操作条件和稳定性，将其分别应用于土壤修复。发现在相同条件下，固定化漆酶的热稳定性和酸碱稳定性优于游离漆酶。该方法可将漆酶和载体牢固结合，但在交联过程中漆酶容易失活。

2.5 两步结合

由于以上方法单独固定化漆酶时会存在一定的缺陷，将两种方法结合起来一起固定化漆酶能表现出优异的性能。Fathali等[30]发现采用交联和包埋组合方法固定化漆酶，表现出良好的操作稳定性和可重复使用性。Wu等[31]首次建立了基于吸附和纤维素衍生物膜涂层相结合的酶固定化方法，该法首先通过物理吸附将酶固定在不同吸附载体上，然后纤维素衍生物膜涂层包覆吸附的固定化酶，可以提高其稳定性。此外该研究者还采用硅藻土和HPD-417(一种吸附树脂)为吸附载体固定化漆酶，表现出较高的稳定性和耐酸碱性。Wu等[32]则通过吸附和共价结合的方法首次将氨基功能化磁性金属有机骨架固定化漆酶，结果发现固定化漆酶的酶活回收率可达83.3%。

2.6 新型固定化技术

固定化技术主要取决于固定化方法和固定化载体材料，而载体材料的选择是酶固定化的关键因素。合适的固定化载体材料能有效提高酶的固定化率和催化效率，因而在国内外许多新型固定化技术的研究都围绕着载体材料展开，这些新型载体材料一般具有多孔性、疏水/亲水性、物化稳定性、表面活性等优异的物化特性。除此之外，近年来研究人员还提出了新型固定化酶制备技术，包括单酶纳米颗粒的制备、微波辐射辅助的固定化技术、无载体固定化技术等[33-34]。交联酶聚集体是一种新型固定化技术，它是用沉淀剂沉淀酶蛋白得到酶聚集体，再用交联剂交联的无载体固定化方法。该方法无需载体，无需纯化，具有成本低、稳定性及重复性较高等优点[35-36]。例如，通过共沉淀法合成了氨基功能化的磁性Fe3O4纳米粒子，并用3-氨基丙基三甲氧基硅烷进行表面改性，将制备的纳米粒子通过磁性交联酶聚集体法固定漆酶[37]。

3 漆酶固定化载体材料

载体材料不仅是固定化漆酶的重要组成部分，还是影响固定化漆酶性能的重要因素之一。选择合适的载体材料能提高固定化漆酶的催化降解能力，并且能产生良好的稳定性和较大的比表面积等优点。载体材料可分为传统材料和新型材料。

3.1 传统材料

3.1.1 无机材料

无机载体材料具有造价低廉、机械强度高以及化学稳定性好等优点，可以直接用来固定漆酶，而对无机材料进行表面改性后可增强其对漆酶的结合能力[38]。常见的无机材料有分子筛、二氧化硅、二氧化钛等。其中，分子筛有许多孔径均匀的孔道和孔穴，其吸附能力高，选择性强，并且耐高温，是一种性能优良的催化剂载体。一般常用的固定漆酶的方法主要是物理吸附法。有报道采用具有微介双孔结构的改性ZSM-5分子筛(ZSM-5 m)为载体，以物理吸附法固定化漆酶，结果发现，与游离漆酶相比，Lac/ZSM-5 m对pH和温度具有良好的耐受性，且具有良好的操作稳定性，循环使用10次，仍能保持初始酶活的69.2%[39]。

二氧化硅表面具有亲水特性以及存在许多羟基，可以通过吸附、共价键和包埋法固定化漆酶[40]。近年来，介孔二氧化硅由于性能优异得到了广泛的关注，但介孔材料固定漆酶时比活力较低。与其相比，大孔材料可提高漆酶的固载量，因而提高了漆酶的比活力，并且大孔材料可加快固定速度和提高反应速率。另有研究指出，经改性后的大孔材料还具有比表面积大、吸附量高、无生理毒性并且孔径可调等特点[39]。例如，以表面固定Cu2+的改性大尺寸SiO2大孔材料作为载体固定化漆酶，在最佳条件下酶活回收率最高可达100.4%，与底物反应重复操作10个批次后酶活仍可达到72.7%[41]。

二氧化钛是典型的无机半导体材料，在光催化领域一直是研究热点，但较少文献报道将漆酶固定在二氧化钛纳米粒子上。与其他纳米粒子相比，二氧化钛由于低成本、无毒性、物理和化学稳定性等独特性能成为固定漆酶的理想载体。例如，将漆酶固定在纳米二氧化钛(ILTN)上，并用ILTN分别降解3种阴离子染料[42]。

3.1.2 高分子材料

天然高分子材料具有良好的生物相容性和降解性，但其力学性能较差。文献报道中，常见的天然高分子材料有壳聚糖、藻酸盐。壳聚糖氨基含量高，可以促进其与漆酶的连接，常用的固定化方法有共价结合法和交联法。王颖等[43]以交联法制备了壳聚糖固定化漆酶，考察固定化漆酶的特性，结果显示，与游离漆酶相比，固定化漆酶提高了稳定性，拓宽了pH和温度的范围。

常用的藻酸盐包括海藻酸钠和海藻酸钙。二者表面富含羧基和羟基，拥有优异的凝胶特性。由于这一特性，常用包埋法将漆酶固定在藻酸盐上，这一优点也使藻酸盐成为常用载体材料之一。图3展示了研究者用戊二醛交联漆酶再包埋到海藻酸钙珠中，可以发现在重复性测试中，与未交联的固定化漆酶相比，先交联后包埋的固定化漆酶在10个循环操作后依然保持高活性[44]。

图3 漆酶的固定化过程及降解双酚A中的应用[44]Fig.3 Process of Laccase Immobilization and Application in Bisphenol A Degradation[44]

与天然高分子材料相比，合成高分子材料性能优良，具有良好的力学性能和可塑性等优点。Georgieva等[45]将漆酶共价固定在化学修饰聚丙烯膜上，发现固定化漆酶在pH值为5.5和温度为55 ℃时表现出最大活性，当在等温条件下的生物反应器中使用固定化漆酶时，它能够氧化多种酚类底物。

3.1.3 复合材料

复合材料是由两种或两种以上不同性质的材料，通过物理或化学的方法，在宏观或微观上组成具有新性能的材料。近年来有不少文献报道了此方面内容。例如，刘晓贞等[46]通过吸附、交联方法制备了二氧化硅/壳聚糖大孔复合材料用来固定化漆酶。庞乾辉等[47]制备了聚多巴胺功能化修饰的整体型大孔/介孔复合材料，通过共价结合法固定化漆酶。另有研究利用埃洛石纳米管和壳聚糖这两种天然资源制备了新型多孔杂化微球，发现其固定漆酶负载量高达123.1 mg/g，固定化漆酶作为生物催化剂去除废水中的苯酚，去除率可达95.0%[48]。可以发现，与单一载体材料相比，复合材料结合了所包含载体材料的优点，表现出更加优异的性能。

3.2 新型材料

新型材料包括碳纳米材料[如碳纳米管(CNTs)、GO]、金属纳米材料、磁性纳米材料以及介孔材料等[49-50]，其具有高比表面积，很大提高了酶的负载量，还可以在纳米尺度上控制尺寸，除此之外还有很好的导电性和磁性等优点[51]。

3.2.1 碳纳米材料

碳纳米材料因其具有良好的导电性、稳定性以及生物相容性等优势一直是研究热点[52-54]。据报道，将CNTs作为载体材料用来固定漆酶已被应用于生物传感、水修复等方向[55]。与传统载体材料相比，CNTs展现了更大的特定表面积、更高的吸附能力以及更优越的酶负载能力。CNTs可分为单壁碳纳米管(SWCNTs)和MWCNTs，其中SWCNTs缺陷少，具有更高的均匀一致性，但MWCNTs具有更多的表面基团，且表面化学活性较高[56-57]。已有文献描述了利用吸附法、共价连接以及包埋将漆酶固定在CNTs上[53]。例如，图4采用了功能化碳纳米管/聚砜膜为载体固定漆酶，并将其降解4-甲氧基苯酚，表现出优异的生物催化性能[58]。还有研究以MWCNTs为填充材料，合成了聚偏氟乙烯/MWCNTs膜纳米复合材料，用共价法固定漆酶表现出显著的活性，与游离漆酶相比，固定化漆酶的操作稳定性和热稳定性有所提高[59]。

图4 漆酶固定在碳纳米管/聚砜膜上及其生物催化性能[58]Fig.4 Laccase Immobilization on CNT/Polysulfone Membranes and the Performance of Biocatalytic Degradation[58]

GO由石墨烯氧化得到，具有吸附性能优异、表面积巨大、表面羟基多等特点，是固定化酶有效的候选载体[60]。与石墨烯相比，GO生产成本低，可大规模生产且易于加工[61]。与其他载体材料相比，GO表面含有丰富的含氧基团，使其具有化学稳定性，并且为GO与其他材料(聚合物或其他无机材料等)复合提供了表面活性位置和较大的比表面积。Xu等[62]将漆酶固定在GO纳米片分离膜上，结果表明，GO-聚醚砜膜固定化漆酶在温度和pH上表现出长期的稳定性，生物膜催化的纯水通量也提高了。GO作为一种性能优异的新型碳材料，在固定漆酶方面虽有较大的潜力，但同时GO也具有一定的局限性,例如易于团聚、电化学活性弱、加工困难等，限制了其应用[61]。

3.2.2 金属纳米材料

作为纳米材料研究的一个重要分支，金属纳米材料由于其物理和化学性质稳定，在众多研究领域表现出了优异的性能，得到了研究人员的广泛关注。例如，图5展示了将纳米铜引入到聚丙烯腈/聚偏氟乙烯电纺纤维膜中，制备了聚丙烯腈/聚偏氟乙烯/Cu2+电纺纤维膜载体用来固定化漆酶，并用于去除水中的2,4,6-三氯苯酚(2,4,6-TCP)[63]。结果表明，固定化漆酶不仅具有较高的重复使用性，而且比游离漆酶具有更宽的pH和温度范围，并且对2,4,6-TCP的去除率高于游离漆酶。

图5 固定化漆酶的制备及其在去除2,4,6-TCP中的应用[63]Fig.5 Preparation of Immobilized Laccase and Application in 2,4,6-TCP Removal[63]

3.2.3 磁性纳米材料

磁性纳米粒子(MNPs)具有强磁性、低毒性、生物相容性以及易于分离等优点，并且其比表面积大，因此,对漆酶负载量较大，可以与底物充分接触，具有良好的催化效果[64-65]。但MNPs存在会在空气或酸性环境下发生氧化或溶解等缺陷，从而限制了其应用，为了克服以上影响因素，需对MNPs进行改性[66]。目前常用的MNPs是Fe3O4，经过表面功能化的MNPs得到了广泛应用。例如，有研究者采用共沉淀法合成乙二胺四乙酸(EDTA)功能化的MNPs，并以Cu2+为桥基的螯合作用将漆酶固定在经EDTA功能化的MNPs表面[67]。

Fe3O4纳米粒子虽然有优越的物理和化学性质，但也存在易于团聚且裸露的Fe3O4粒子表面没有官能团等缺陷，而与其他材料(如高分子材料)复合能有所改善。高分子材料表面具有丰富的官能团，与MNPs构成磁性复合材料得到广泛应用。Zhang等[68]采用共价交联方法有效地将漆酶固定在Fe3O4@壳聚糖复合纳米粒子表面，固定化漆酶的比活性达到112.4 U，酶活性回收率为51.8%。另有报道，首次将漆酶固定在基于Cu2+螯合的含2,2-二胺-二-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸的氨基功能化离子液体修饰的磁性壳聚糖纳米粒子上，研究发现，固定化漆酶与游离漆酶相比具有较高的活性、稳定性以及较好的pH和温度适应性[69]。

在磁性纳米材料中，磁性二氧化硅因其具有比表面积大、孔径可调节、表面容易修饰等特点被广泛应用[70]。与无机材料二氧化硅相比，磁性二氧化硅增加了磁性材料的特点，如强磁性、低毒性、易于分离等。因此，磁性二氧化硅在固定漆酶方向得到了更广泛的应用。Hu等[71]通过交联法将漆酶固定在具有核壳结构的氨基官能化磁性二氧化硅纳米粒子上，研究发现固定化漆酶拓宽了pH和温度范围，提高了耐受性而且表现出更高的稳定性。

3.2.4 介孔材料

介孔材料是一类孔径在2～50 nm的多孔材料。其中，介孔二氧化硅由于其孔径均匀、比表面积大等特点成为固定漆酶的理想载体[72]，但其不利于回收。而磁性介孔二氧化硅在磁场作用下，能够快速分离，实现固定化漆酶的回收再利用。至今有不少关于磁性介孔二氧化硅研究和应用的报道。Zhu等[73]研究了磁性介孔二氧化硅球；Li等[74]报道了磁性介孔SiO2/Fe3O4空心微球的合成；Wang等[75]合成了具有虫孔骨架结构的新型大孔磁性介孔二氧化硅纳米粒子。可以发现，将漆酶固定在磁性介孔二氧化硅材料上，固定化漆酶的稳定性以及重复利用率显著提高，并经过多次磁分离操作后，其仍保持高活性。

4 结论与展望

漆酶是一种很有前途的生物催化剂，其催化底物范围广、催化效率高、贮存要求低，且反应后唯一的产物是水。大部分漆酶在降解污染物时，最适pH值在3～7，且最适温度较低,在25～50 ℃。漆酶容易受到pH和温度的影响，因此，游离漆酶具有易失活、低重复利用率和差稳定性等缺点。漆酶固定化后不仅可以克服以上缺点，而且具有良好的催化性能和较宽的底物范围，在热、酸碱度、储存和操作方面的稳定性都有了显著提高。但是漆酶在固定化后，其活性会降低，性能也会受到固定化方法的影响，并且酶活回收率不高，同时漆酶的高成本问题也限制了其应用，现在漆酶固定化方面多为试验研究，在实际中应用较少。因此，漆酶的固定化技术和载体材料需更进一步的研究。

(1)研究新的固定化方法和有前途的载体材料依然是未来漆酶固定化技术的一个趋势，旨在提高固定化漆酶的活性。

(2)由于漆酶的高生产成本限制了其应用，需开发新的技术或者优化现有的工艺设备来降低工艺的生产成本。

(3)近年来，新型污染物越来越多，未来可开展固定化漆酶应用于去除新型污染物的研究，拓宽漆酶的应用范围。

(4)需进一步开发漆酶更多的优异性能，将固定化漆酶应用到更多的领域。