荞麦抗性糊精制备工艺的条件优化及其结构表征

苏有韬, 王维浩,2, 魏春红, 武云娇, 王一飞, 赵姝婷, 刘德志, 曹龙奎,2

(黑龙江八一农垦大学食品学院1，大庆 163319) (黑龙江八一农垦大学国家杂粮工程技术研究中心2，大庆 163319)

膳食纤维具有调节血糖[1，2]，血脂和肠道菌群的作用[3]。根据其溶解性，又可分为水溶性膳食纤维(SDF)和水不溶性膳食纤维(IDF)[4]，抗性糊精是一种小分子SDF，又称作难消化糊精，是一种以淀粉为原料深加工的产物，具有耐消化和良好的加工特性，如热稳定，易溶于水和低黏度等特点，在面包中应用可以改善面包的口感和色泽[5]；在饮料加工中可以代替高能量饮料中部分脂肪和糖类，开发出低GI饮料[6]；添加到乳制品中可以强化乳品中所缺少的膳食纤维，并不会影响乳品本身的质构；因抗性糊精具有抑制血糖和胰岛素的上升，所以在保健品等领域也有涉及[7-9]。

荞麦是一种重要的功能性食品，其主要组成成分为淀粉，质量分数为60%～70%[10]。荞麦淀粉在工业上被广泛应用，但在食品工业上研究较少[11]，将荞麦淀粉加工成抗性糊精，应用到食品加工工业上[12]，将具有非常大的潜力，同时也拓展了荞麦淀粉在食品领域的应用前景。因此，本研究将以荞麦淀粉为原料，利用酸热法制备荞麦抗性糊精，探究糊精化前后二者在结构上的差异，并为荞麦抗性糊精在食品领域的应用提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料和仪器

荞麦米、耐高温α-淀粉酶(4×104U/g)、淀粉葡萄糖苷酶(1×105U/mL)；溴化钾:光谱级；盐酸、氢氧化钠、无水硫酸钠、水杨酸、无水乙醇：分析纯。

SU8020场发射电子扫描电子显微镜，D8 ADVANCE X射线衍射仪，NP-800PRF偏光显微镜，Nicolet 6700傅里叶变换红外光谱仪，WSC-S测色色差仪，DGG-9053A型电热鼓风干燥箱，DK-S24型恒温水浴锅，TGL16B型台式离心机。

1.2 方法

1.2.1 荞麦淀粉的提取

荞麦淀粉的提取参照周小理等[10]的方法，称取新鲜荞麦500 g，进行除杂清洗，多次水洗后，按照水与荞麦质量比1∶2.5进行浸泡，再加入4 g的无水硫酸钠固体粉末，用盐酸(1 mol/L)调节pH到2，于35 ℃下浸泡24 h后，换水磨浆4次，并多次过滤，直到充分洗出淀粉，再将滤液离心(5 000r/min，10 min)得到粗淀粉，将粗淀粉经盐酸(0.01 mol/L)漂洗，荞麦粗淀粉与洗液质量比为1∶10，漂洗3次后离心(5 000 r/min，10 min)；再经NaOH(0.000 1 mol/L)漂洗，荞麦粗淀粉与洗液质量比为1∶15，漂洗3次，离心，沉淀溶解于蒸馏水，调溶液pH到7，离心(5 000 r/min，10 min)后除去上层及底部残渣，放置烘箱45 ℃干燥48 h，得荞麦淀粉，得率为(58.9±2.71)%。

1.2.2 荞麦抗性糊精的制备工艺

荞麦抗性糊精的制备参考文献[13]的方法，并加以修改，具体操作为：称取一定量的荞麦淀粉，用0.1 mol/L盐酸进行喷洒加入淀粉中，进行搅拌混匀，保证淀粉与盐酸充分接触，获得以干淀粉为基础的0.15%的最终盐酸浓度，再放入烘箱(温度55 ℃)干燥到水分<5%，再放入烘箱高温热解，热解温度160 ℃，热解时间100 min，即可得到粗品糊精，加3倍淀粉质量的蒸馏水溶解，在用浓度为0.1%盐酸溶液和0.1%氢氧化钠溶液调节pH至5.5，加入1%的耐高温α-淀粉酶，并水浴加热(95 ℃、2 h)，灭酶(100 ℃，10 min)，再调节pH至4.5，加入0.1%的淀粉葡萄糖苷酶水浴加热(55 ℃、4 h)，灭酶(100 ℃，10 min)；放入离心机进行离心(4 000 r/min、10 min)，在加入3倍液体体积的95%的乙醇，边加入边搅拌至沉淀产生，静置4 h后，倒掉上清液，沉淀55 ℃烘干至恒重，得到荞麦抗性糊精，计算公式为：

式中：m为荞麦抗性糊精得率/%；m1为荞麦抗性糊精质量/g；m2为荞麦淀粉质量/g。

1.2.3 荞麦抗性糊精DE值测定[14]

采用3.5-二硝基水杨酸比色法进行糊精DE值测定。

1.2.3.1 制作葡萄糖标准曲线

利用3.5-二硝基水杨酸比色法测定葡萄糖含量，准确称取已烘至恒重的葡萄糖100 mg，溶解定容至100 mL容量瓶中，移取0.00、0.10、0.30、0.50、0.70、0.90、0.11 mL上述标液于25 mL具塞刻度试管中，加入蒸馏水补至2 mL，分别加入2 mL 3.5-二硝基水杨酸试剂后于沸水浴中加热5 min，流水迅速冷却，转移至25 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容，用分光光度计在波长为520 nm 处测定吸光度，绘制标准曲线。标准曲线回归方程为y=6.533 6x+0.036，R2=0.997 0，y为标准溶液在520 nm处吸光度，x为葡萄糖含量/(mg)。

1.2.3.2 样品测定

样品适当稀释后，使其质量浓度为0.2 mg/mL，取稀释液2 mL，加入2 mL 3.5-二硝基水杨酸试剂后于沸水浴中加热6 min，流水迅速冷却，转移至25 mL容量瓶中，加入蒸馏水定容，用分光光度计在520 nm波长处测定吸光度，计算出样品中还原糖含量。

1.2.3.3 葡萄糖当量(DE)值的测定

式中：DE为葡萄糖当量值/%；C1为还原糖含量/g/mL；C2为总固形物含量/g/mL。

1.2.4 荞麦抗性糊精的色度[15]

采用WSC-S测色色差仪测定。结果用L*、a*、b*3个参数表示；其中L*表示亮(白)度,a*表示红色至绿色, b*表示黄色至蓝色。

1.2.5 荞麦抗性糊精单因素实验方法1.2.5.1 盐酸添加量对得率的影响

称取10.00 g荞麦淀粉，喷洒盐酸，获得以干淀粉为基础的0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%的最终盐酸浓度，酸热温度160 ℃，酸热时间100 min，酶解，离心取上清液，醇沉，干燥称重，得到荞麦抗性糊精，计算得率。

1.2.5.2 酸热温度对得率的影响

称取10.00 g荞麦淀粉，喷洒盐酸，获得以干淀粉为基础的0.15%的最终盐酸浓度，酸热温度120、140、160、180、200 ℃酸热时间100 min，酶解，离心取上清液，醇沉，干燥称重，得到荞麦抗性糊精，计算得率。

1.2.5.3 酸热时间对得率的影响

称取10.00 g荞麦淀粉，喷洒盐酸，获得以干淀粉为基础的0.15%的最终盐酸浓度，酸热温度160 ℃，酸热时间60、80、100、120、140 min，酶解，离心取上清液，醇沉，干燥称重，得到荞麦抗性糊精，计算得率。

1.2.6 荞麦抗性糊精正交优化实验

在单因素实验的基础上进行正交实验设计，以盐酸添加量、酸热温度和酸热时间为单因素，荞麦抗性糊精得率和DE值为指标，采用L9(34)进行优化最佳制备工艺。设计制备工艺水平表，见表1。

表1 正交实验因素水平表

1.2.7 荞麦淀粉与荞麦抗性糊精的微观结构1.2.7.1 偏光十字测定方法[16]

称取一定质量荞麦淀粉于离心管中，配置1%的淀粉溶液，抗性糊精则用95%乙醇配置，取0.1 mL溶液于载玻片上，盖上载玻片，将气泡赶走，在合适的放大倍数下在偏光显微镜下观察淀粉和抗性糊精。

1.2.7.2 扫面电镜测定方法[17]

取适量样品，将其分散于贴有双面胶的样品台上，通过离子溅射喷金使样品导电后，之后置于扫描电子显微镜，20 kV加速电压下分别调整放大倍数，观察5.00 μm和50.00 μm下荞麦淀粉和荞麦抗性糊精的表面结构。

1.2.8 红外光谱测定方法

利用傅里叶红外光谱仪进行测定，将荞麦淀粉和荞麦抗性糊精分别与KBr混合研磨，利用真空压片机进行压片，在4 000～400 cm-1范围进行红外光谱扫描。

1.2.9 X-射线衍射测定方法[18]

将荞麦淀粉及荞麦抗性糊精进行干燥、粉碎，采用X-射线衍射仪测定。

1.2.10 分子质量测定方法[19]

参照王娟等方法，称取适量样品于容量瓶中，用流动相溶解，定容。色谱条件：色谱柱：TSKgel GMPWXL,流动相：水相，少量硝酸钠、叠氮化钠，流速：0.5 mL/min, 柱温：30 ℃,进样量：20 μL。

1.2.11 数据处理与分析

所有实验均进行3次平行，取其平均值，采用SPSS 26.0对数据进行处理并分析，采用 ANOVA 对数据进行差异显著性分析(P<0.05)；采用origin 9.5软件进行绘图。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果与分析

从图1可以看出，随着盐酸添加量的增加，荞麦抗性糊精的得率也随之增加，在盐酸质量分数为0.2%左右得率趋于平稳，相关研究表明，盐酸添加量增多，会使荞麦淀粉降解出小分子物质，加剧了小分子物质在高温条件下重新聚合，能被α-淀粉酶和糖化酶酶解的糖苷键被破坏，形成了不被酶解的糖苷键，例如α-1,2、α-1,3、β-1,2和β-1,6 糖苷键，但随着盐酸添加量增加，发生了热降解，单糖从抗性糊精上脱落，生成大量小分子单糖，单糖含量变多，经过酶解，生成大量还原糖，DE值反映了抗性糊精经过醇沉，其中还有经过酶解残留的还原糖，因此DE值增高；同时抗性糊精颜色会发生变化，由白色逐渐变成黄色，并伴随有焦糊气味产生，会不利于抗性糊精后期的脱色处理，所以在盐酸质量分数0.2%最好[20]。

制备荞麦抗性糊精，固定盐酸质量分数为0.15%，酸热时间为100 min。从图1可以看出，荞麦抗性糊精的得率与酸热温度升高呈线性关系，温度越高，得率越增加，在升高至160 ℃之后得率缓慢增加，达到200 ℃含量有所下降，DE值随着温度升高而降低，到160 ℃开始升高，这是因为荞麦淀粉经过酸解和高温，生成不被α-淀粉酶和糖化酶酶解的新结构，抗性含量增加，得率增加，DE值降低，在更苛刻的条件下，会有更大程度的转葡萄糖和再聚合的可能发生，导致抗性糊精与分子质量略有增加，但也会含有较短的支链产生[21]，同时生成小分子物质，在较低温度下，不利于其再聚合，单糖含量增大，抗性糊精得率下降很多，在经过酶解，生成大量还原糖，DE值含量增大表示抗性糊精中有部分还原糖，在高温条件下，热分解导致得率下降，大量小分子单糖脱落，也会导致DE值增大，同时糊精颜色逐渐由白色变成黄褐色，水溶性增加，并伴随产生焦糊味，不利于对后期的处理，最佳酸热温度为160 ℃。

制备荞麦抗性糊精，固定盐酸质量分数为0.15%，酸热温度160 ℃。从图1可以看出，随着酸热时间的增加，抗性糊精的得率也随之增加，在时间100 min时，得率趋于平稳，达到51%不再增加，同时抗性糊精颜色随时间的增大而逐渐由白色变成黄褐色，总体来看，酸热时间对抗性糊精的得率影响趋势不大，DE值在时间120 min时达到最低，达到20.2%，继续增加酸热时间不利于抗性糊精的形成，经过酶解，反而会使残留的抗性糊精中还原糖增加，导致了DE值增大，为后期进一步纯化处理很麻烦，不利于在食品工业上计算成本和效率问题，因此，最佳酸热时间为120 min。

图1 不同条件对抗性糊精得率和DE值的影响

2.2 荞麦抗性糊精正交优化实验分析

正交实验结果见表2，方差分析见表3、表4，通过R值的大小可知，影响得率的因素排序为盐酸添加量>酸热温度>酸热时间，影响DE值的因素排序为盐酸添加量>酸热温度>酸热时间，通过表3和表4可知盐酸添加量和酸热温度对得率影响极显著(P<0.01)，酸热时间显著(P<0.05)，盐酸添加量和酸热温度对DE值影响显著(P<0.05)，酸热时间不显著；影响得率的最优组合为A2B2C2，影响DE值的最优组合为A2B2C1，根据能耗和成本计算综合考虑，确定荞麦抗性糊精制备工艺最优组合为A2B2C1，即盐酸质量分数为0.2%，酸热温度180 ℃，酸热时间100 min。

表2 正交实验结果

表3 荞麦抗性糊精制备工艺优化得率方差分析表

表4 荞麦抗性糊精制备工艺优化DE值方差分析表

2.3 验证实验

通过正交实验确定最佳工艺条件为盐酸添加量为0.2%；酸热温度180 ℃；酸热时间100 min；结果表明，荞麦抗性糊精得率为(56.8±0.45)%，DE值为(19.9±0.71)%，高于单因素最佳得率和低于单因素最佳DE值，证明该工艺可行性。

2.4 淀粉与抗性糊精色度分析

如表5所示，荞麦淀粉制备荞麦抗性糊精其颜色变化明显，这是由于在高温条件下，淀粉发生焦糊化反应，颜色由白色变为黄色，L*由93.62降低到45.95，代表颜色更偏离白色；a*由0.43升高到7.05，代表颜色更偏向红色；b*由4.11升高到7.03，代表颜色更偏向黄色。

表5 荞麦淀粉与荞麦抗性糊精色度

2.5 微观结构测定结果与分析

2.5.1 偏光十字测定结果与分析

由图2a可知，荞麦淀粉的双折射现象呈现出偏光十字，这是淀粉球晶结构所具有的，这种变化在一定程度上反映了荞麦淀粉支链的螺旋形成结晶的径向取向和荞麦淀粉的结晶结构[22，23]。由图2b可知，淀粉特有的结晶结构已破环，无法观察到偏光十字，呈碎片状，由于淀粉通过酸热处理，使淀粉的结构发生了改变。

图2 荞麦淀粉与荞麦抗性糊精偏光十字图(×400)

2.5.2 扫描电镜测定结果与分析

由图3可以观察出由荞麦淀粉变成荞麦抗性糊精，结构发生了明显的改变，证实了严酷的条件可以有效地摧毁了淀粉颗粒内部有秩序的结构[21]。左侧荞麦淀粉形状多是球形和不规则的多面体形，颗粒较小，而右侧荞麦抗性糊精则失去淀粉原有的结构，呈现出小碎片和小碎片聚合的块状，这是因为淀粉分子在酸热过程中，失去了原有的分子结构，形成了很多链状结构和单糖，又重新进行无规律的聚合，进行酶解纯化后，形成大小不一，无规则，多孔状结构，导致水分子有利于渗透，使水溶性增加。

图3 荞麦淀粉与荞麦抗性糊精的扫描电子显微镜图

2.5.3 红外光谱测定结果与分析

图4 荞麦抗性糊精(A)与荞麦淀粉(B)的红外光谱图

2.5.4 X-衍射测定结果与分析

从图5观察荞麦淀粉和荞麦抗性糊精的XRD衍射结果，荞麦淀粉的晶型是A型，在2θ为15.35°、17.12°、18.03°、23.43°出现衍射峰，与现有研究一致[24]；由淀粉制备抗性糊精，晶型发生了很大的改变，原有的衍射峰消失，在20°左右出现衍射峰，晶型属于非晶型，可以得知，经过酸解和高温的处理，淀粉的结构发生了明显的改变，与抗性糊精明显不同，通过扫描电镜观察结果一致。

图5 荞麦淀粉(A)与荞麦抗性糊精(B)的X射线衍射谱图

2.6 抗性糊精的分子质量

通过表6可以得知荞麦抗性糊精平均分子质量为3 895 u，相对于淀粉这种多糖聚合物，是一种小分子的物质，结合图2，更进一步说明了结构发生了明显变化，经过破坏聚合，生成了糖类物质，可以推断，淀粉经过酸和高温处理，在经过酶解，结构发生了变化，链状结构被破环，生成了大量小分子的多糖结构。

表6 荞麦抗性糊精分子质量测试结果

3 结论

以荞麦淀粉为原料，采用了酸热法制备抗性糊精，通过单因素实验和正交优化，确定了最佳工艺条件为盐酸质量分数0.2%；酸热温度180 ℃；酸热时间100 min；制备荞麦抗性糊精的得率为56.8%，DE值为19.9%，通过酸热处理，抗性糊精由白色变成黄色，水溶性增加，结构有了明显的改变，表面粗糙疏松多孔，呈无规则形状，平均分子质量为389 5 u，属于小分子量的水溶性膳食纤维。