遮阴对栓皮栎幼苗的生长生理及叶片解剖结构的影响1)

薛旭鹏 尤海舟 吴一晗 陈炳成 陈驸昌 于玮玮

(天津农学院，天津，300392) (河北省林业和草原科学研究院) (天津农学院)

光照是影响植物生长及种群更新的重要生态因子之一，也是植物进行光合作用获得生长所需能量的来源[1]。不同的光照环境，会改变植物的形态、生长特性[2]。遮阴会造成植物的生理代谢和叶片性状特征发生变化[3]，丙二醛(MDA)质量摩尔浓度、超氧化物歧化酶(SOD)活性、脯氨酸(Pro)和可溶性糖(Ss)等物质的量会发生变化[4]。遮阴对植物叶形态的影响主要为叶片厚度降低和比叶质量减少[5]。气孔孔径大小及气孔开度，可以反应植物的蒸腾、呼吸、光合速率的快慢[6]。植物的光合速率与叶片解剖结构有关[7]，对植物进行遮阴处理会导致栅栏组织细胞变短，细胞间隙增大，组织结构紧密度、栅海比减小，组织结构疏松度增大[8]，从而影响植物的光合作用。

栓皮栎(QuercusvariabilisBlume)为壳斗科栎属多年生乔木，主要分布在北纬22°～42°、东经99°～122°区域，木栓层发达，是我国生产软木的主要原料[9]。栓皮栎橡子淀粉、蛋白质、单宁含量高，可提取栲胶。栓皮栎为喜光树种，成熟的栓皮栎林中会导致林下光照不足，致使实生苗中等径级的个体数量多，大径级个体数量偏少[10]。关于栓皮栎的研究，主要集中在生物生态学特性、环境胁迫等方面[11]，而关于遮阴对栓皮栎幼苗生长及生理动态的研究较少。为此，本研究以种植于天津农学院苗圃2年生栓皮栎移植盆栽幼苗为试材，设置遮阴率为20%、40%、60%的3个遮阴处理，以全光照为对照(CK)，对栓皮栎幼苗进行遮阴处理试验，每个处理和对照各6株，重复3次；遮阴处理80 d后，按照规范方法测定幼苗生长生理指标、气孔特性及叶片解剖结构；采用层次分析法、单因素方差分析、最小显著差异法，分析栓皮栎幼苗的耐阴性、遮阴对栓皮栎幼苗的生长生理及叶片解剖结构的影响。旨在为栓皮栎实生苗圃实施科学管理，提升育苗质量提供参考。

1 材料与方法

试验选用2年生栓皮栎实生苗。栓皮栎种子由天津农学院马闯老师提供，于2019年4月份，挑选饱满、无病害的种子播种于天津农学院苗圃，正常水肥管理。于2020年7月1日，挑选长势相近的幼苗，移栽至育苗盆中(盆上口内径38.0 cm、盆底内径30.0 cm、盆内高40.5 cm)，盆中基质为V(蛭石)∶V(草炭)=1∶1。经过15 d的适应，于7月16日开始进行为期80 d的遮阴处理。

试验设置3个遮阴处理，遮阴率分别为20%(T1)、40%(T2)、60%(T3)，全光照为对照(CK)，分别按相应处理搭建遮阳网。每个处理和对照各6株，重复3次。遮阴处理80 d后测定生长生理指标，观测气孔特性及叶片解剖结构。

生长指标测定：遮阴处理开始时，栓皮栎幼苗的株高为(255.35±2.74)mm、叶面积为(2.979 5±0.024 9)cm2。遮阴处理80 d后，测定最终株高、叶面积，并计算株高增长量(Phi)、叶面积增长量(Lag)；株高使用游标卡尺测量，叶面积采用画纸称质量法测量。

生理生化指标测定：遮阴处理80 d后，各生理生化指标分别称取栓皮栎幼苗叶片0.02 g进行测定。用蒽酮比色法测定脯氨酸质量分数、酸性茚三酮法测定可溶性糖质量分数、硫代巴比妥酸法测定丙二醛质量摩尔浓度、考马斯亮蓝G-250法测定可溶性蛋白质量分数、高锰酸钾滴定法测定过氧化氢酶(CAT)活性、氮蓝四唑法测定超氧化物歧化酶活性[12]。

气孔及叶片解剖结构测定：采用指甲油印迹法[13]测定气孔密度(SD)、气孔开度(SO)、气孔面积(SA)。采用常规石蜡切片法[14]观测叶片解剖结构，切片厚度8～10 μm，番红-固绿对染，并于显微镜下测量栅栏组织厚度(TP)、海绵组织厚度(TS)、主脉厚度(TMV)、叶片厚度(TL)、上表皮厚度(TUE)、下表皮厚度(TLE)。计算细胞结构紧密度(CTR)、细胞结构疏松度(SR)、栅海比(RPS)、叶脉突起度(VPD)。

气孔开度=πab，a为1/2的叶长、b为1/2的叶宽；

细胞结构紧密度=栅栏组织厚度/叶片厚度；

细胞结构疏松度=海绵组织厚度/叶片厚度；

栅海比=栅栏组织厚度/海绵组织厚度；

叶脉突起度=叶脉厚度/叶片厚度。

灰色关联度计算方法：正相关指标=(Xab-Xmin)/(Xmax-Xmin)、负相关指标=1-(Xab-Xmin)/(Xmax-Xmin)；式中Xab为a遮阴处理的b指标测定值，Xmax为b指标的最大值，Xmin为b指标的最小值。

式中：x0(k)为k指标的最大隶属函数值，xi(k)为i处理时生理生化及叶片解剖结构指标的隶属函数值。第一级最大差Δimax=kmaxΔi(k)，第二级最大差Δmax=imaxΔimax；第一级最小差Δimin=kminΔi(k)，第二级最小差Δmin=iminΔimin。利用ξi(k)取平均数进行排序。

采用层次分析法[15]对遮阴处理的栓皮栎幼苗生长生理、气孔及叶片解剖结构进行综合评价并排序。用单因素方差分析、最小显著差异法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 遮阴对栓皮栎幼苗株高及叶面积增长量的影响

由表1可见：栓皮栎幼苗的株高增长量随遮阴率的增加先增后减，遮阴率为20%、40%、60%的处理均显著高于全光照(对照)，且比较全光照(对照)上升幅度分别为225.8%、230.7%、100.2%。栓皮栎幼苗的叶面积增长量随遮阴率的增加先增后减，遮阴率为20%的处理显著高于全光照(对照)，比全光照(对照)上升7.5%；遮阴率为40%、60%的处理显著低于全光照(对照)，比全光照(对照)的下降幅度分别为60.6%、60.2%。遮阴率为20%处理时，栓皮栎幼苗的株高增长量及叶面积增长量均处于较高水平。

表1 不同遮阴处理时栓皮栎幼苗株高及叶面积的增长量

2.2 遮阴对栓皮栎幼苗生理生化的影响

由表2可见：栓皮栎幼苗叶片中的脯氨酸质量分数随遮阴率的增加先减后增，在遮阴率为20%处理时最低；遮阴率为20%、40%的处理，显著低于全光照(对照)、遮阴率为60%的处理；遮阴率为20%、40%的处理，比全光照(对照)减小幅度分别为76.4%、55.8%；遮阴率为60%的处理与全光照(对照)无显著差异。栓皮栎幼苗叶片中的可溶性糖质量分数随遮阴率的增加先减后增，在遮阴率为20%处理时最低；遮阴率为20%、40%的处理，显著低于全光照(对照)、遮阴率为60%的处理；遮阴率为20%、40%的处理，比全光照(对照)减小幅度分别为61.0%、28.1%；遮阴率为60%的处理与全光照(对照)无显著差异。栓皮栎幼苗叶片中的可溶性蛋白质量分数随遮阴率的增加先减后增，在遮阴率为20%处理时最低；遮阴率为20%、40%的处理，显著低于全光照(对照)、遮阴率为60%的处理；遮阴率为20%、40%的处理，比全光照(对照)减小幅度分别为54.3%、43.5%；；遮阴率为60%的处理与全光照(对照)无显著差异。试验测定的3个渗透调节物质均在遮阴率为20%处理时最低。

由表2可见：随遮阴率的增加，栓皮栎幼苗叶片中的丙二醛质量摩尔浓度呈先减后增趋势，各处理均显著低于全光照(对照)。遮阴率为20%的处理显著高于遮阴率为40%、60%的处理，遮阴率为40%处理时最低；遮阴率为40%处理与遮阴率为60%处理，差异不显著；遮阴率为20%、40%、60%的处理，比全光照(对照)降低幅度分别为18.0%、47.0%、41.5%。

表2可见：栓皮栎幼苗叶片过氧化氢酶的活性随遮阴率的增加先减后增，在遮阴率为20%处理时最低；遮阴率为20%、40%的处理，比全光照(对照)下降幅度分别为56.7%、24.7%；遮阴率为60%处理，比全光照(对照)上升幅度为47.5%。栓皮栎幼苗超氧化物歧化酶的活性随遮阴率的增加先增后减，在遮阴率为20%处理时最高，遮阴率为20%处理比全光照(对照)上升幅度为19.7%；遮阴率为40%、60%处理，比全光照(对照)下降幅度分别为11.0%、22.4%。

表2 不同遮阴处理时栓皮栎幼苗生理生化指标测定结果

2.3 遮阴对栓皮栎幼苗叶片气孔的影响

选择长势及着生部位相同的叶片进行气孔观察，由表3可见：各处理的气孔密度均低于全光照(对照)，且其他处理之间没有显著性差异；遮阴率为20%、40%、60%处理，比全光照(对照)下降幅度分别为26.1%、29.2%、36.7%。气孔开度和气孔面积随遮阴率的增加呈显著上升，遮阴率为40%的处理与遮阴率为20%的处理无显著差异，遮阴率为40%的处理与遮阴率为60%的处理无显著差异。遮阴率为20%、40%、60%处理的气孔开度，比全光照(对照)上升幅度分别为21.5%、35.2%、47.1%。遮阴率为20%、40%、60%处理的气孔面积，比全光照(对照)上升幅度分别为26.1%、45.7%、63.9%。

表3 不同遮阴处理时栓皮栎幼苗叶片气孔特征测定结果

2.4 遮阴对栓皮栎幼苗叶片解剖结构的影响

由表4可见：栓皮栎幼苗叶片的主脉厚度随遮阴率的上升逐渐减小，遮阴率为20%、40%、60%的处理，比全光照(对照)下降幅度分别为7.2%、18.5%、28.3%。各处理的叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度均小于全光照(对照)，且遮阴率为40%与遮阴率为60%的处理无显著差异；遮阴率为20%、40%、60%处理的叶片厚度，比全光照(对照)下降幅度分别为13.0%、25.1%、32.7%；遮阴率为20%、40%、60%处理的栅栏组织厚度，比全光照(对照)下降幅度分别为19.0%、30.0%、34.9%；遮阴率为20%、40%、60%处理的海绵组织厚度，比全光照(对照)下降幅度分别为9.1%、17.4%、21.9%。各处理的细胞结构紧密度，与全光照(对照)无显著差异。细胞结构疏松度则随遮阴率的上升而增加，全光照(对照)与遮阴率为20%、40%处理均无显著差异，遮阴率为40%与遮阴率为60%处理无显著差异，遮阴率为60%处理比全光照(对照)上升了16.1%。遮阴率为20%、40%、60%处理的栅海比，皆小于全光照(对照)，且分别下降了11.1%、14.2%、16.6%；遮阴率为20%、40%、60%处理之间无显著差异。各处理叶脉突起度与全光照(对照)无显著差异。遮阴处理时的栓皮栎幼苗叶片上表皮厚度显著低于全光照(对照)，遮阴率为20%处理与遮阴率为40%处理无显著差异，遮阴率为40%处理与遮阴率为60%处理无显著差异；遮阴率为20%、40%、60%处理的栓皮栎幼苗叶片上表皮厚度，比全光照(对照)减少幅度分别为27%、38.4%、49.1%。遮阴率为40%、60%处理的下表皮厚度，显著低于遮阴率为20%的处理、全光照(对照)，遮阴率为20%的处理与全光照(对照)无显著差异；遮阴率为40%、60%处理的下表皮厚度，比全光照(对照)下降幅度分别为25.6%、39.7%。

表4 不同遮阴处理时栓皮栎幼苗叶片解剖结构的测定结果

遮阴率/%叶片解剖结构细胞结构疏松度/%栅海比叶脉突起度上表皮厚度/μm下表皮厚度/μm全光照(0.422±0.026)b(0.888±0.048)a(7.963±0.454)a(18.146±2.087)a(9.211±0.347)a20(0.439±0.010)b(0.789±0.018)b(8.489±0.539)a(13.240±2.625)b(8.532±0.351)a40(0.464±0.010)ab(0.752±0.009)b(8.649±0.167)a(11.172±0.587)bc(6.850±0.079)b60(0.489±0.037)a(0.740±0.006)b(8.490±0.476)a(9.232±1.137)c(5.552±0.582)c

2.5 不同遮阴处理时栓皮栎幼苗生长及生理生化指标的灰色关联度值及其排序

使用灰色关联法计算栓皮栎幼苗生长、生理生化、叶片气孔、叶片解剖结构指标的隶属函数值，并根据隶属函数值计算灰色关联度值，通过灰色关联度值求取平均值并依次排序。经不同遮阴处理：栓皮栎幼苗生长指标，由强到弱依次为遮阴率为20%、遮阴率为40%、全光照(对照)、遮阴率为60%(见表5)；栓皮栎幼苗生理生化指标，由强到弱依次为遮阴率为20%、遮阴率为40%、全光照(对照)、遮阴率为60%(见表6)；栓皮栎幼苗气孔指标，由强到弱依次为全光照(对照)、遮阴率为40%、遮阴率为60%、遮阴率为20%(见表7)；栓皮栎幼苗叶片组织结构指标，由强到弱依次为全光照(对照)、遮阴率为20%、遮阴率为40%、遮阴率为60%(见表8)。

表5 不同遮阴处理时栓皮栎生长指标灰色关联度值及其综合排序

表6 不同遮阴处理时栓皮栎生理生化指标灰色关联度值及其综合排序

表7 不同遮阴处理时栓皮栎叶片气孔指标灰色关联度值及其综合排序

表8 不同遮阴处理时栓皮栎叶片组织结构指标灰色关联度值及其综合排序

2.6 不同遮阴处理时栓皮栎幼苗生长的综合评价

将不同遮阴处理的各指标分为生长、生理、气孔及叶片解剖结构。生长、生理中各指标可以直接反应植株的生长状况；气孔各指标，既受光照影响，也受周围环境中CO2的影响；叶片组织结构中各指标较小，有利于叶片对光能的吸收，却不利于叶片对外界机械损伤的抵抗。综合以上特点，设置判断矩阵，并计算归一化的权重值(见表9)。

表9 不同遮阴处理时栓皮栎幼苗各评价指标的判断矩阵及归一化权重值计算

应用层次分析法将栓皮栎幼苗生长、生理生化、叶片气孔、叶片解剖结构指标的灰色关联度值计算加权关联度，依据加权关联度依次排序。经不同遮阴处理，栓皮栎幼苗生长由强到弱依次为遮阴率为20%、遮阴率为40%、全光照(对照)、遮阴率为60%(见表10)。

表10 不同遮阴处理时栓皮栎幼苗各评价指标的加权关联度及综合排序

3 讨论与结论

株高及叶面积是反应植物生长动态非常重要的指标，过强或过弱的光照环境均不利于植物进行正常的光合作用[16]。植物可以通过增加株高、叶面积有效利用光辐射，提高光能利用率[17]。本研究结果表明，适度遮阴有利于栓皮栎幼苗株高的增长。通过增加株高，以达到林分上层，这是大多数成年喜阳植物的特性，而林分内较高的郁闭度也要求植物幼年需具有一定的耐阴性。适度遮阴可以增加植物的叶面积，栓皮栎林下的透光率较低，植物可以通过增加叶面积获得更多与光照的接触面积，过低的透光率则会导致植物将更多的生物量用于株高的生长，以突破较高郁闭度对其的束缚。

植物体的渗透调节物质主要有两大类，一是由外界进入细胞的无机盐类；二是细胞自身合成的有机溶质，脯氨酸、可溶性糖和可溶性蛋白是植物体中主要的有机渗透调节物质[18]。大量的研究表明，许多植物体内的脯氨酸在遭受非生物胁迫时可以得到积累，并增加细胞渗透压以减轻细胞的溶质酸[19]。同时脯氨酸也被证实自身具有氧化活性，可以有效清除植物体内的活性氧[20]，也能够保护蛋白质的完整性，并提高不同酶的活性[21]。可溶性糖和可溶性蛋白是调节渗透胁迫的小分子物质，在植物对环境胁迫的适应性调节中，可以促进二者有效积累[22]。遮阴条件下，植物对于可溶性蛋白的合成受到抑制，降解加速，且与发生的变化呈正相关趋势[23]。一定的遮阴会使可溶性糖含量减少[24]，低光胁迫会通过提高可溶性糖和淀粉的含量保证植物正常代谢[8]。本研究中，栓皮栎幼苗脯氨酸质量分数、可溶性糖含量、可溶性蛋白质量分数先减后增。说明强光照对幼苗产生不利的影响，植物体内积累更多的脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白等渗透调节物质，以抵御强光照对植物体产生的损伤。在20%遮阴时，脯氨酸质量分数、可溶性糖质量分数、可溶性蛋白质量分数等渗透调节物质最低，与对照相比，下降显著，说明20%遮阴有利于栓皮栎幼苗的生长，细胞可以正常进行水分及离子交换，不需要过多的渗透调节物质积累辅助。但随着遮阴率的增加，栓皮栎幼苗叶片中的渗透调节物质逐渐升高，至60%遮阴时，上升到对照的水平，说明中度和高度遮阴会造成栓皮栎幼苗的渗透胁迫，从而激发植物体积累较多的渗透调节物质进行抵抗。

丙二醛为脂质在自由基的作用下发生过氧化反应的产物，可以加剧膜损伤，且作为研究植物衰老生理和抗性生理的指标，丙二醛质量摩尔浓度能够反应细胞膜的破坏程度[25]。本研究中，丙二醛质量摩尔浓度随遮阴率的增加呈先降低后增加的趋势，在40%遮阴时最低，且显著低于全光照(对照)，这与杨柳[26]等的研究结果不同，其原因是该研究只使用了85%的遮阴处理，高梯度的遮阴比全光照更加不利于栓皮栎幼苗的生长。在全光照(对照)和所有的处理中，对照组的丙二醛质量摩尔浓度最高，即膜脂过氧化程度最高，说明全光照条件时不利于栓皮栎幼苗的生长。本研究结果表明，一定程度遮阴有利于栓皮栎幼苗的生长。

在无应力条件下，活性氧的形成和去除是平衡的，在植物体的酶促保护系统中，主要包括超氧化物酶、过氧化物酶、过氧化氢酶等，其中超氧化物酶处于核心地位，构成了对抗活性氧的第一道防线[27]。遮阴，通过影响植物的抗氧化酶系统，改变植物的抗逆性，并维持其活性氧的动态平衡[26]。本研究中，随着遮阴率的增加，栓皮栎幼苗的过氧化氢酶活性变化，与脯氨酸、可溶性糖、可溶性蛋白的变化呈正相关趋势，均在20%遮阴时数值最低，而超氧化物歧化酶活性随遮阴率增加呈先增后降趋势。低度遮阴时，超氧化物歧化酶活性高于其他处理，说明该处理时栓皮栎幼苗受到了较好的保护，且超氧化物歧化酶作为对抗活性氧的第一道防线，足以抵御活性氧产生，此时活性氧并未对植株产生伤害，因此不需要其它渗透调节物质抵抗。本研究表明，过氧化氢酶与超氧化物歧化酶没有表现出一致性的变化，说明不同的酶对于光照强度的敏感性和适应性不同，但二者共同协助机体抵御不良的环境。

气孔控制着植物与外界环境的气体和水分交换，遮阴可以造成植物气孔改变，提高光合作用[28]。气孔密度及气孔大小主要反应了植物对环境湿度和光强的适应。本研究结果表明，遮阴会使栓皮栎幼苗气孔密度降低、气孔面积增大、气孔开度增大。这是由于遮阴处理，通过降低气温、增加土壤水分含量，减少气孔密度，增加气孔大小和气孔开度，从而导致蒸散量增加，但利于植物的光合作用。

光照强度发生变化时，植物最直观的表现可以从叶片解剖结构反映出来。本研究结果表明，栓皮栎幼苗叶片厚度、叶脉厚度等均随遮阴率的增加而降低。这是因为遮阴可使植物叶片变大、变薄，适应弱光环境[29]。遮阴会导致栅海比减小，这是因为低光强下，栅栏组织减少，海绵组织相对更发达，有利于减少光量子透射的损失，提高叶片在弱光下的光能利用率[30]。细胞结构紧密度、栅海比、叶脉突起度、上表皮厚度、下表皮厚度，与光合速率呈正相关[7]。本研究中，叶片厚度、主脉厚度、上下表皮厚度呈逐渐降低的趋势，表明遮阴在一定程度上降低了植物的光合速率。遮阴条件下，植物周围的环境温度降低、蒸散量减少、光照强度减弱，植物叶片的解剖结构发生变化。这说明栓皮栎幼苗可以通过调节叶片结构适应遮阴环境。

本研究运用层次分析法对栓皮栎幼苗的生理生化、气孔、叶片解剖结构指标进行研究，结果表明，在20%的遮阴处理时最适宜栓皮栎幼苗的生长，其次是40%的遮阴处理，全光照和60%的遮阴处理对栓皮栎幼苗的生长具有一定的抑制作用。夏季是幼苗高生长的高峰期，应在此时加强苗圃的管护，此时期光照强度大，应使用20%遮阴率的遮阴网以促进栓皮栎幼苗的生长发育。