一株高效微生物絮凝菌的筛选与鉴定1)

2022-09-08吴丽红邵楠韩红玉孙瑞婷冯邱思杜荣杰

东北林业大学学报 2022年8期

吴丽红邵楠韩红玉孙瑞婷冯邱思杜荣杰

(辽宁科技学院，辽宁·本溪，117002)

在水和废水处理过程中，絮凝可以去除水中的浊度、色度、COD、BOD等指标和一些溶解性的杂质，该技术现己被广泛用于给排水、废水处理和污泥脱水等领域，絮凝剂的种类与性能会直接影响絮凝效果。传统的絮凝剂主要分为无机絮凝剂和有机絮凝剂两大类[1]，这些絮凝剂均是用于工厂废水处理的有效絮凝剂；但是形成的絮凝废渣不能或难于被生物降解，会造成二次污染。

微生物絮凝剂是一类由微生物产生的有絮凝活性的代谢产物或有絮凝活性的菌体，主要成分为糖蛋白、多糖、蛋白质、纤维素等。微生物絮凝剂不但具有传统絮凝剂的特点，而且具有无毒无害、无二次污染，使用范围广，净化效果好，生产和使用成本较低等优点[2-3]。

我国从20世纪80年代以来展开对微生物絮凝刑的研究，但是目前对微生物絮凝剂的应用研究多处于实验室阶段，大规模的应用还比较少[4-5]。本研究以活性污泥作为絮凝剂菌种来源，在特定培养基中富集驯化、选择培养，进行絮凝菌的分离、筛选，并对优选菌株进行初步鉴定，旨在为微生物絮凝剂的研制开发提供参考。

1 研究方法

本研究以某污水处理厂二沉池剩余活性污泥作为菌种来源。

1.1 絮凝菌的分离、纯化与筛选

牛肉膏蛋白胨富集培养基[6]：在1 L水中培养基各成分——牛肉膏为5 g/L、蛋白胨为10 g/L、NaCl为5 g/L、pH为7.2～7.5，121 ℃灭菌20 min。固体培养基加入15 g/L的琼脂作为凝固剂。

絮凝菌筛选培养基[7]：在1 L水中培养基各成分——葡萄糖为20 g/L、K2HPO4为5 g/L、KH2PO4为2 g/L、NaCl为0.1 g/L、(NH4)2SO4为0.2 g/L、尿素为0.5 g/L、酵母膏为0.5 g/L、MgSO4为0.5 g/L，pH为7.8，105 ℃灭菌30 min。

1.1.1 絮凝菌的培养与分离纯化

将采集的剩余活性污泥样品置于锥形瓶中，用无菌蒸馏水稀释，加入几粒玻璃珠进行充分震荡摇匀后，静置20 min后，用无菌移液管吸取10 mL上清液注入含有100 mL富集培养液的250 mL锥形瓶中。置于恒温振荡器中(30 ℃)，调节转速为120 r/min，震荡培养48 h[8]。

采用倍比稀释法，将富集培养后的混合培养液制得10-1～10-7的菌悬液；用接种环分别蘸取10-3～10-7的混合菌悬液，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行划线分离，置于恒温生化培养箱30 ℃培养，48 h后根据不同菌落特征再分别挑取菌落进行划线分离；反复操作，直至获得单菌落。结合显微镜观察菌种的形态特征，获得纯菌落后进行斜面培养保存备用。以上操作均为无菌操作条件下完成。

1.1.2 微生物絮凝产生菌的筛选

絮凝菌培养液制备：在无菌操作条件下，用接种环分别少量挑取上述已经纯化的菌落，置于含100 mL絮凝菌筛选培养基的250 mL的锥形瓶中，温度30 ℃、摇床转速120 r/min的条件培养48 h获得菌种培养液。

絮凝菌初筛：絮凝微生物的筛选，以菌种培养液对高岭土悬浮液的絮凝效果判定，取菌株培养液测其对高岭土悬浮液的絮凝率。取200 mL的量筒，加入150 mL的质量浓度为8 g/L的高岭土悬浊液，同时向量筒内加入40 mL菌株培养液和10 mL质量分数为1%的CaCl2溶液，充分混合后静置20 min，以加入不加菌的絮凝菌筛选培养基的高岭土悬浊液为对照进行目测观察，选出有明显的絮凝效果的菌种，完成初筛。

复筛：复筛是对初筛得到的菌种进行进一步的筛选，采用混凝试验进行絮凝菌的絮凝能力测定[9]。将初选出来的菌种按“絮凝菌培养液制备”方法制成菌悬液，在烧杯中加入质量浓度为4 g/L的高岭土悬浊液500 mL，再按5%的接种量加入25 mL的初筛菌株培养液，并加入5 mL质量分数为10%的CaCl2水溶液作为助凝物质。置于六联搅拌器，以150 r/min搅拌5 min之后，静止20 min；相同条件下，以加入不加菌的絮凝菌筛选培养基的高岭土悬浊液为对照。混凝结束后，采用可见光分光光度计在550 nm波长条件测定不同烧杯中上清液的吸光值。以投加絮凝菌培养液高岭土上清液的吸光值(A1)、对照高岭土上清液吸光值(A2)，计算絮凝率=[(A2-A1)/A1]×100%，用不同菌种的絮凝率定量表示其絮凝效果。通过复筛得到具有较高絮凝率的菌株，将复筛纯菌株进行斜面培养，待其充分生长后，置于冰箱中4 ℃保藏备用。

菌种优选：经过复筛后，对优选出的代表菌株进行相关特性分析，优选出絮凝性能最好的絮凝菌。

1.2 优选菌株特征的检验方法

借鉴文献[10]，通过优选菌种固体平板培养特征、半固体培养特征、液体培养特征，检验高效絮凝菌的培养特征。

优选菌株的生理生化试验：通过对高效絮凝菌进行革兰氏染色镜检，鉴别菌株的革兰氏染色特性及显微形态；通过生理生化试验检验菌种代谢的多样性。本研究共设计了优选菌株接触酶试验、含碳化合物及含氮化合物的分解等12项生理生化指标。

优选菌株的16S rDNA的序列测定：对优选菌株在进行形态观察及生理生化试验的基础上，进行16S rDNA序列测定，从分子生物学的角度进一步鉴定其属种。

优选菌株的时间生长曲线：挑取少量优选菌株菌落，置于牛肉膏蛋白胨液体培养基，以空白培养基为参比，测定接菌量吸光值，在30 ℃、120 r/min条件进行恒温摇床培养，定时取样测定培养液吸光值，绘制优选菌株的生长曲线。

2 结果与分析

2.1 高效絮凝菌的筛选

污泥经驯化培养后共分离纯化16株菌，经初筛后16株菌中7种有絮凝效果，7株菌分别标记为X1、X2、X3、X4、X5、X6、X7。通过混凝试验，对7株菌进行絮凝率测定复筛，并对产生的絮体外观进行观察测定(见表1)。由表1可见：有3株菌株(X1、X5、X6)具有明显的絮凝效果；3株菌(X1、X5、X6)形成的絮凝体颗粒较大，X6更大些。根据试验结果，综合考虑絮凝率与絮体颗粒大小，优选出絮凝性能最好的菌株为X6，作为代表菌株进行后续试验。

表1 复筛菌株的絮凝率及絮体颗粒大小

2.2 优选菌株X6的培养特征

菌株X6的固体平板菌落相关特性(见图1(1))——单菌落为直径1～2 mm较小的乳白色圆形菌落，隆起形状为低凸，菌落边缘形状规则，没有向外扩展，菌落不透明，易被接种环挑起，黏稠。从在半固体培养基的生长情况看(见图1(2))，菌种仅在半固体培养基表面及沿穿刺线生长，没有外扩现象。所以菌株X6不具有运动性，且具有兼性厌氧的呼吸类型。在液体培养基中的生长情况取决于菌体的密度，由图1(3)可见，菌株X6的液体培养基上部清澈，菌种以菌团的形式沉降到试管底部，说明其密度大于培养基密度。从培养特征可看出，菌株X6应为无鞭毛、能产生荚膜的细菌。

图1 优选菌株X6的培养特征

2.3 优选菌株X6的生理生化检验

菌株X6经革兰氏染色镜检呈紫色(见图2)，所以为革兰氏阳性菌，菌体形状为杆状，且清晰可见菌体中有芽孢。对菌株X6进行生理生化指标检测结果见表2。综合各项指标的测定，并经检索，将絮凝菌X6鉴定到属，为芽孢杆菌属。

图2 菌株X6革兰氏染色结果

表2 菌株X6生理生化指标的测定结果

2.4 16S rDNA的序列测定

利用分子生物学技术，对菌株X6进行了16S rDNA序列测定分析。将测得的序列采用DNA序列分析软件(Sequcecher软件)进行拼接，去掉载体序列及重复序列，得到菌种jc1的16SrRNA序列(有效序列长度1 488 bp)。以BLASTN软件在基因数据库(GenBank)中进行相似性检索，菌株jc1与贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis，Genbank Accession No.MT573877.1)同源性达到99.86%。

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)是环境中常见的具有广泛功能性的细菌种类，而其分类地位与物种名称的确定却是细菌分类研究者一直以来争论的焦点，直到最近贝莱斯芽孢杆菌有效的物种名称才得到确定[11]。贝莱斯芽孢杆菌在自然界中广泛分布，对人类和动物无害，不污染环境。其代谢产物丰富，具有广谱抗菌活性和较强的抗应激能力，因此该细菌在农业、环境和发酵工业等许多领域发挥着越来越重要的作用[12]。

2.5 优选菌株的生长曲线

通过分批培养，在波长为600 nm条件测定菌株X6的吸光值，定时取样，绘图得到株菌的X6生长曲线(见图3)。

由图3可见：菌株在前12 h内吸光值增量很少，前期曲线平缓，斜率约为0，此时菌株X6属于适应期；此后12 h内吸光度增长量逐渐增大，从加速期进入指数生长期，约48 h菌量达到最大，增长进入稳定期；48 h后，缓慢进入衰亡期。说明菌株X6最佳生长时间是分批培养后12～48 h，所以在研究菌种特性时可取该期菌种作为研究对象。稳定期是收获菌体或代谢产物的最佳时期。在水处理过程中，常规活性污泥法一般应用稳定期菌种，该期菌体代谢活力虽然比对数期差，但代谢活力也较强，而且稳定期菌体生物吸附能力强，泥水分离效果好，出水水质好，所以培养48h左右的稳定期菌种可作为菌种絮凝活性研究对象。