动脉粥样硬化实验动物模型及方法的研究进展*

杨定法，赵庆宇婧 综述，颜红娇，赵声兰△ 审校

(1.云南中医药大学，昆明 650500；2.昆明海关技术中心 650100)

动脉粥样硬化(AS)是一种慢性血管疾病，是许多心血管病的基础，例如冠心病、动脉疾病、急性心肌梗死等。2020年中国心血管健康与疾病报告推算中国约3.30亿人患心血管病，其患病率一直持续升高，其病死率位列各疾病之首[1]。AS致病因素包括遗传、年龄、饮食习惯、高血糖、高血脂和高血压等。2016年中国大约有240万人死于AS，占心血管疾病死亡人数的61%，占所有死亡人数的25%[2]。2020年在全球30～79岁人群中，约有19.4亿人患有不同发展时期的AS病症，AS已严重影响着人类的健康[3]。

AS病变由轻到重有6型：Ⅰ型是最初的病变，动脉内膜适应性增厚，大量脂蛋白诱导内膜巨噬细胞增多并形成充满脂滴的巨噬泡沫细胞[4-5]。Ⅱ型病变主要包括脂肪条纹，肉眼可见动脉内膜表面的黄色条纹、斑块或斑点。Ⅲ型病变也称为中间病变、过渡性病变和AS前病变，在动脉内膜适应性增厚的平滑肌细胞层之间形成脂质池。Ⅳ型病变细胞外脂质积聚形成脂核(脂质核心)，脂质核心引起了严重的内膜紊乱，使动脉壁增厚，内膜平滑肌细胞和深层内膜的细胞间基质排列分散等。Ⅴ型病变有明显的新纤维结缔组织形成，中膜平滑肌细胞排列紊乱、数量减少，动脉出现不同程度的狭窄。Ⅵ型病变是复杂病变，在Ⅳ型和Ⅴ型病变的基础上出现病变斑块表面的破裂、血肿或出血及血栓沉积等。

目前，构建AS实验动物模型主要通过高胆固醇、高脂肪饮食诱导形成，但与人体病变相比，并不完全一致。在大多数AS实验动物模型中，动物并不总是按照预想，发展形成斑块破裂、心肌梗死和猝死等并发症[6-7]。理想的AS模型应与人体病变相似，且能应用于相关医药研究中。所以构建一种与人类发病机制、临床表现相似或接近的动物模型是探究AS发病机制和研发有效治疗药物的关键。

1 动 物

用作AS模型的动物须易于获得，能以合理的成本维护，容易处理并具有明确的遗传特征[8]。此外，动物最好在食用与人类相似的饮食后能自发发生病变。目前，常用于建立AS模型的动物包括大鼠、小鼠、豚鼠、小型猪和家兔等，各有其优缺点，见表1。

表1 几种常用AS模型动物的比较

1.1大鼠

大鼠长期给予胆酸钠、丙基硫氧嘧啶以及高脂肪、高胆固醇的饮食能发展成AS病变，但同时伴有体重明显减轻和病死率高。建立动物模型通常选择6～8周龄雄性Wistar或SD大鼠。ZHAO等[9]选用SD大鼠，给予高脂饮食(总胆固醇3.0%，基础饲料81.3%，猪油10.0%，蔗糖5.0%，丙基硫氧嘧啶0.2%，胆酸钠0.5%)喂养9周，结合维生素D3建立AS大鼠模型。

1.2小鼠

C57BL/6J纯系小鼠能用来构建AS模型，含15%脂肪、1.25%胆固醇、0.5%胆酸的高脂饮食喂养14周会形成高胆固醇血症和散在的脂肪斑块等AS病变，但病变较小，没有进展到纤维斑块[10]。随着胚胎操作技术与DNA同源重组技术的成熟与应用，出现了基因改造小鼠。现在普遍认为基因改造小鼠是检测AS特定基因靶点缺失或过度表达最重要的动物模型，它对研究AS分子机制和有潜在价值的途径非常重要。目前常用的基因改造小鼠有ApoE-/-小鼠和LDLr-/-小鼠。研究发现普通饲料喂养ApoE-/-小鼠可形成AS斑块，LDLr-/-小鼠只会出现小病变[11]；高脂饮食诱导，ApoE-/-小鼠比LDLr-/-小鼠病变的速度更快，所以ApoE-/-模型更广泛用于实验性AS研究[12]。

1.3豚鼠

豚鼠与人类有许多相似之处，包括拥有多种代谢脂蛋白的酶，脂蛋白代谢与人类类似；显示出与人类相似的肝胆固醇合成和分解代谢速率；豚鼠和人类在从血浆中清除LDL的机制上具有相似之处等。豚鼠对高胆固醇饮食十分敏感，通常豚鼠摄入高胆固醇饲料一段时间后即可形成早期AS斑块。

1.4家兔

家兔是AS研究使用较多的动物之一。它的脂蛋白谱与人类相似，表达胆固醇酯转移蛋白，且吸收外源性胆固醇能力强，容易形成AS病变[13]。构建AS模型兔通常选取3～4月龄的新西兰大耳白兔或日本大耳白兔，单独喂食高胆固醇饮食或联合动脉球囊损伤等方法，诱导主动脉发生粥样硬化病变[8]。值得注意的是，新西兰大耳白兔长期高胆固醇喂养易导致高胆固醇血症，大量炎症和肝毒性发展，导致脂肪肝和黄疸等。IZIDORO等[14]采用高胆固醇饮食(0.2%)加腹主动脉球囊内皮剥脱术诱导新西兰白兔，建立实验性AS模型。

1.5小型猪

小型猪是构建AS动物模型较为理想的动物。从生理、生化及解剖学等角度看，小型猪和人类都很像，其大动脉的解剖结构90%与人相同，低密度脂蛋白结构和载脂蛋白等与人类似。由于上述相似性，小型猪AS模型可作为架桥工具，将从大鼠、小鼠等其他小动物模型研究中获得的知识转化为人类AS药物的开发[15]。ZHAO等[16]通过给予近交系五指山小型猪高胆固醇高脂饮食，检测发现6个月腹主动脉和髂动脉出现斑块病变，8个月冠状动脉出现斑块病变，12个月所有的主要动脉都发现AS病变，最严重的部位出现了脂核、胆固醇沉淀和钙沉积。

利用CNKI数据库，以AS模型为主题检索2010-2020年的相关文献，然后再分别以大鼠、小鼠、豚鼠、兔、小型猪为主题在结果中检索。使用大鼠和小鼠建立AS模型的相关文献较多，且越来越多的研究者选择ApoE-/-小鼠；使用小型猪和豚鼠的相对较少。

2 高脂饲料诱导

AS的表征之一是血脂质积聚，是动物长期食用高胆固醇、高脂饮食的结果。高脂饲料配方依据模型动物、造模方法、实验目的和条件的差异而定，通常是普通饲料加适量的胆固醇、猪油、白糖、蛋黄粉等组成。猪油可使饲料更好成形，白糖可以改善高脂饲料的口感，增加动物的食欲。值得注意的是大鼠和C57BL/6J纯系小鼠具有抗AS的特性，在选取它们建立模型时，高脂饲料中需添加丙基硫氧嘧啶和胆酸钠[17]。丙基硫氧嘧啶能抑制甲状腺功能、降低胆固醇代谢；胆酸钠可提高肠道对脂肪和胆固醇的吸收[18]。

高脂饲料诱导操作简便、成本低，且符合人类饮食的特点，但建模周期长，模型不易成功，较难发展为晚期AS病变。以高脂喂养作为基础，再联合腹腔维生素D3、免疫炎症诱导、机械损伤和基因改造等方法，可较好建立AS晚期动物模型。但高脂饲料不同配方对血脂TG、TC和LDL-C等指标的影响有一定差异(表2)。

表2 几种高脂饲料配方及喂食相应饲料后不同动物模型血脂指标变化率

3 高脂饲料结合维生素D3诱导

此方法主要用于构建AS大鼠模型。维生素D3是钙离子诱导剂，可诱发血管钙化，升高血液中血钙水平，损坏动脉壁，加快AS病变。大鼠无胆囊，脂质吸收率低，仅靠高脂饲料很难形成AS病变，高脂饲料诱导的同时给予维生素D3，能有效提高模型成功率。LIAN等[25]高脂饮食诱导的同时单次腹腔注射维生素D3，12周后大鼠形成了明显AS病变。但该方法维生素D3的给药剂量需严格控制，剂量过低或过高都影响模型的建立。目前不同研究者维生素D3给药剂量和频率有一定差异(表3)。

表3 维生素D3的几种给药剂量和给药方式

4 免疫炎症诱导

AS是一种慢性炎症性的血管病变。炎性反应贯穿了AS的所有阶段：从内膜中的脂质蓄积到斑块形成和最终破裂。细胞炎性因子的表达增加，炎性细胞的形成等都促进了AS的发生与发展。炎症诱导方法通过给予牛血清白蛋白、肺炎衣原体和幽门螺杆菌等形成免疫刺激，诱发免疫炎性反应。

4.1病原体诱导法

病原体感染与AS病变密切相关。用于AS模型研究的病原体有幽门螺杆菌和肺炎衣原体等。幽门螺杆菌感染能让巨噬细胞、中性粒细胞、T细胞和B细胞等聚集，提高C-反应蛋白、 IL-6、IL-8和TNF-α等的水平，诱导动脉发生局部炎性反应，内皮细胞钙离子浓度升高，加速AS发展。肺炎衣原体会与血管细胞相互作用产生氧化应激，进一步促进泡沫细胞的形成，并通过刺激血小板活化和VSMC增殖、迁移等促进AS病变的形成。陶珍等[30]采用雄性新西兰兔在喂食高脂饲料(1%胆固醇、15%鲜蛋黄、5%猪油、79%基础饲料)的基础上，经耳缘静脉注射幽门螺旋杆菌，成功建立兔AS模型。

4.2牛血清白蛋白法

唐曦等[31]比较两种方式(仅给予高脂饲料：88.5%普通饲料、7.5%蛋黄粉、6%胆固醇、4%猪油；给予相同高脂饲料的同时，每周肌内注射250 mg/kg胎牛血清白蛋白)构建新西兰大白兔AS模型，发现高脂饲料复合免疫损伤家兔血脂水平更高，粥样斑块病变更严重。刘剑刚等[32]用日本大耳白兔喂食高脂饲料，同时给予250 mg/kg牛血清白蛋白，15 d后再次给予250 mg/kg牛血清白蛋白，72 d后可以观察到兔主动脉有斑块形成，血脂水平显著增高。

5 机械损伤诱导

脂质沉积与内皮损伤是AS病变的两大基本因素。当内皮细胞损伤时，动脉内膜的完整性、通透性发生改变，脂质积聚在受损内膜处，形成泡沫细胞并不断积累构成脂肪斑块，进而形成AS斑块。内皮损伤包括直接损伤和间接损伤。

5.1球囊损伤法

该方法是通过球囊的膨胀和拖拉直接造成动脉内皮损伤和脱落。YANG等[33]采用反复球囊损伤腹主动脉，结合高脂饲料的方法成功建立兔主动脉粥样硬化斑块模型。张莉等[34]采用球囊损伤术加高脂饲料(1%胆固醇、15%猪油、15%花生油、20%蛋黄粉、1%食盐、48%普通饲料)连续饲喂小型猪12周后，颈总动脉血管内膜增厚，内膜及中膜均有泡沫细胞，动脉壁上有不同程度的钙化斑块形成等。

5.2动脉钳夹术

该方法是物理阻断动脉的正常供血，间接造成颈动脉内膜损伤，促进AS斑块的形成。王庆林等[35]给予大鼠高脂饮食 (10%蛋黄、8%猪油、0.2%丙基硫氧嘧啶、0.5%胆盐、4.8%食盐)，并进行颈动脉钳夹操作，6周后观察到AS病变。李土明等[36]给予Wistar大鼠高脂饮食和腹腔注射维生素D3的同时进行颈总动脉钳夹手术，构建了颈总动脉粥样硬化大鼠模型。

6 基因改造动物模型

转基因动物是指把外源基因稳定整合在动物染色体基因组内，并且能遗传给后代的一类动物。大量研究表明，ApoE敲除鼠和LDL受体基因敲除鼠动脉可发生明显的AS病变，且具有人类粥样斑块的典型特征，是研究AS最重要、最常用、最经典的转基因动物模型。近年超过95%的AS研究都是基于载脂蛋白E缺乏或低密度脂蛋白受体缺乏的动物[37]。

6.1ApoE基因敲除小鼠模型

ApoE是一种糖蛋白，主要在肝脏和大脑中合成，是除低密度脂蛋白外所有脂蛋白颗粒的结构成分。它在脂蛋白代谢中发挥重要作用，还能抑制脂蛋白氧化，减少OxLDL等形成，减少泡沫细胞的形成[38]。1992年PIEDRAHITA等通过胚胎干细胞的同源重组技术成功地复制出ApoE基因敲除小鼠，以基因为靶点的小鼠模型改变了AS研究的面貌，形成了新的AS理论[39]。ApoE-/-小鼠清除血浆脂蛋白的能力严重受损，在正常饮食下，乳糜粒残留物、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白胆固醇含量明显升高，血浆总胆固醇浓度达3～5 mg/mL。此外，缺乏ApoE会增加对饮食脂肪和胆固醇的敏感性，喂食高胆固醇、高脂肪饮食后，血浆胆固醇水平会进一步升高，加速AS病变的进程[40]。

6.2LDL-R基因敲除小鼠模型

LDL受体是一种膜受体，通过介导富含胆固醇的LDL的胞吞作用来维持血浆LDL水平，还参与相关脂蛋白内化和代谢。1993年ISHIBASHI等以基因打靶技术成功培养LDL-R基因敲除小鼠，其血浆中脂蛋白增多，血胆固醇水平升高，易形成AS病变。该模型的特点有：首先，血浆胆固醇主要由LDL颗粒携带，脂质分布和人类更相似。其次，由于缺乏功能性LDL受体，LDLr-/-小鼠模型能观察到在人类家族性高胆固醇血症中出现的特征。最后，与ApoE缺乏症相比，LDL受体的缺乏对炎症没有影响。因此，该小鼠模型中的AS斑块形成主要是基于血浆脂质水平升高，而与炎症和LDL受体相关的其他功能无关。

6.3其他转基因动物模型

ApoE/LDL受体双敲除小鼠是一种可自发形成AS病变的动物模型，在规律饮食的情况下，病变情况比ApoE-/-小鼠或LDLr-/-小鼠都更严重。ApoE3-leiden小鼠能表达可检测的内源性ApoE水平，这为研究升高的血脂质水平而不干扰炎症过程提供了可能性[41]，当喂食高胆固醇、高脂饮食时，血浆总胆固醇和甘油三酯水平大幅升高，形成晚期AS病变。ApoE-/-兔在正常饮食中表现出轻度高脂血症，对胆固醇饮食诱导的AS高度敏感[42]。此外，国内外研究者还建立了PCSK9-AAV小鼠、ApoE-/-小型猪、ApoE-/-大鼠、LDLr-/-大鼠、LDLr-/-兔等多种AS转基因动物模型。

简而言之，人们做出了许多研究来建立尽可能类似于人的AS动物模型，然而当前的每种动物模型都有其优点和局限性，人们通常只能根据实验需求和条件选择合适的模型。建立自发性(即没有机械干预)斑块破裂、尽可能具有类似于人的AS病变进程，最终能发展形成卒中、猝死或心肌梗死等的动物模型仍需进一步研究。