长非编码RNA在儿童肠息肉中的差异表达*

朱丹荣，盛伟松，孙 玥，刘志峰，季国忠，李 楠

(1.南京医科大学第二附属医院儿童内镜中心 210003；2.南京医科大学附属儿童医院儿科消化 210004；3.南京医科大学第二附属医院消化医学中心 210003；4.南京医科大学附属伊犁哈萨克自治州友谊医院儿科消化，新疆 835000)

结肠息肉为一种儿童消化系统常见疾病，是导致儿童下消化道出血的主要病因[1]。绝大部分为良性病变，但也有文献报道导致恶变可能[2]。儿童肠息肉会导致免疫力降低，贫血，甚至可引起外科急腹症如肠套叠等。当前文献对于儿童肠息肉的病理和治疗报道较多，但对其发病机制暂无明确报道[3]。KELLEHER等[4]认为结直肠息肉的产生与基因变化有关。目前，肠镜仍是诊治儿童肠息肉的“金标准”[5]，但由于肠镜是一种侵入性操作，且需要麻醉的配合，患儿家长的顾虑使肠镜的广泛和及时应用受到一定限制，因此很多时候儿童肠息肉并不能得到最及时的诊治。

随着现代细胞分子生物学的快速发展，人们在分子水平上对许多疾病的发生、发展及其相关机制展开了研究，催生出许多疾病的分子靶向治疗的新兴理念，这一领域的进步使得许多疾病的诊治手段增加，且疗效得到提升[6]。所以，在分子水平层面深入研究儿童肠息肉发生、发展的作用机制，找出其特异性的特征性分子可能为儿童肠息肉的临床诊治提供新的方向和方法。

本研究采集儿童肠息肉组织及正常肠黏膜组织(息肉病理检查证实为幼年性息肉)，因儿童的特殊性及实验经费的限制，以3例配对正常肠黏膜和肠息肉，外加4例儿童肠息肉(共7例息肉)开展了儿童肠息肉组织的长非编码RNA(lncRNA)测序研究，随后分别在60例儿童肠息肉组织及配对的正常肠黏膜组织标本中运用RT-qPCR验证了6个差异表达lncRNA基因。

1 材料与方法

1.1材料来源

选取3例配对正常肠黏膜和肠息肉，外加4例儿童肠息肉，共7例肠息肉，所有标本均获取患儿的家属书面同意并且通过南京医科大学第二附属医院伦理委员会批准(2018KY087)。儿童肠息肉组织及正常肠黏膜组织均来自诊断为儿童肠息肉的患儿并经病理检查证实为幼年性息肉。儿童肠息肉组织标本来自离体肠息肉组织，正常肠黏膜组织标本取自正常肠管组织或离息肉5 cm以上肠组织。本研究获得研究对象的家属的知情并同意参与。

1.2方法

1.2.1标本处理

病理诊断为幼年性息肉的患儿在肠镜检查中收集所需标本，息肉标本取材黄豆粒大小，正常肠黏膜组织采取活检钳夹取3块组织，用磷酸盐缓冲液洗3次，登记编号，将编号后的样品分别置于液氮中低温保存。整个采集及处理时间均为自标本组织离体10 min内(Xirou3编号因质检原因舍去)。

1.2.2资料收集

收集样本的编号、来源部位、年龄、性别、体重指数(BMI)等基本资料，见表1。肠息肉和正常肠黏膜样本性别、年龄、BMI比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表1 基本资料

表2 两组样本一般资料比较

1.2.3总RNA提取

RNA 的抽提使用AMBION试剂盒(试剂货号AM1561，试剂批号1409128)。

1.2.3.1制备组织匀浆

取2 mL离心管(附带螺旋盖子)，将研磨珠(直径1 mm)放入离心管，位置放至离心管1 mL处。将实验标本组织切成小块置入2 mL离心管中(带研磨珠)，加入TRIzol试剂(即用型细胞和组织总RNA提取试剂)直到离心管顶部。旋转拧紧离心管螺旋盖，仔细检查螺旋盖和离心管结合部，保证没有研磨珠夹杂其中，用密封圈密封离心管的管口以便能尽可能减少制备组织匀浆过程中气体溶胶的生成。于均质器内对称的置入离心管后盖上均质器上盖，机器运行3 min。

1.2.3.2相位分离

完成制备标本组织匀浆后样品在15～30 ℃环境中孵育5 min以便保证核蛋白复合体充分裂解。然后将氯仿(与Trizol比例为5∶1)注入离心管中，与Trizol试剂的比例为5∶1，充分摇匀，孵育3 min，放入离心管中进行离心，温度选择4 ℃，时间为12～15 min。

1.2.3.3RNA沉淀

转移含有标本RNA的上层无色液体至新的离心管中，首先沉淀标本RNA，然后加入异丙醇试剂。Trizol试剂和异丙醇试剂按照2∶1的比例配置，加入完成以后相同的温度条件以12 000 r/min离心12～15 min，弃上清液。

1.2.3.4RNA清洗

以75%乙醇冲洗RNA沉淀，配置乙醇与Trizol试剂，比例1.5∶1.0，以7 500 r/min离心4～5 min。

1.2.3.5RNA再溶解

取70 μL的去RNase液，风干RNA沉淀物10 min，将沉淀物放入去RNase液中。用微量加样器反复抽吸吹打，最后标本RNA孵育10 min，温度为50 ℃。

1.2.4总RNA的纯化和RNA质检

使用QIAGEN RNeasy@Mini Kit 纯化样品总RNA。利用Agilent Bioanalyzer 2100检测RNA完整性。采用Thermo Scientific 生产的NnaoDrop ND-2000检测，具体操作步骤：(1)开机运行NnaoDrop ND-2000(Thermo Scientific)超微量分光光度计，清洁NnaoDrop ND-2000检测头和检测孔(用洁净擦镜纸)，反复用超纯水滴滴入检测孔，对合检测头检测孔；(2)吸出超纯水(作为空白对照组)，用微量加样器吸取1 μL RNA样本溶液，留置于检测孔，点击“测量”键，读取RNA样本的吸光度值。

1.2.5cDNA的构建

(1)配置反应溶液，200 ng总RNA(5 ng polyA+RNA)2.5 μL，Spike Mix 2 μL，随机引物0.8 μL，总量为5.3 μL。(2)将反应溶液按要求配置好，在65 ℃的环境下静置10 min，随后冰浴5 min，将5×First缓冲液预热5 min(80 ℃)。(3)配置cDNA合成体系。(4)PCR，40 ℃ 2 min，70 ℃ 15 min，冰浴5 min。

1.2.6高通量测序

测序工作由上海美吉生物有限公司完成。

1.2.7RT-qPCR

每个RT-qPCR(20 μL)体系中含2×qPCR Master Mix 10 μL，正向引物(10 μmol/L)0.2 μL，反向引物(10 μmol/L)0.2 μL，cDNA 2 μL，ROX染料0.4 μL，以及ddH2O至20 μL。反应条件：扩增曲线95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s；熔解曲线95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，95 ℃ 15 s，共40个循环。以GAPDH为内参，应用2-ΔΔCt法，计算目的基因相对表达量，引物序列见表3。

1.2.8生物信息学分析

采用David数据库进行基因本体(GO)分析，用京都基因与基因线百科全书(KEGG)数据库进行Pathway分析。

1.3统计学处理

2 结 果

2.1相关分析、聚类热及火山

样本间均无显著相关性，差异无统计学意义(P>0.05)；两组样本直接基因表达量存在显著差异，有多个差异基因显著上调或下调，见图1。

表3 引物序列

A:聚类热图；B:火山图。

2.2GO及KEGG分析

差异基因主要富集在信号传导、免疫系统、内分泌系统、消化系统及癌症等相关通路上。

2.3差异表达的lncRNAs验证

测序发现存在1 307+738条差异表达的mRNA，共598条明显表达差异的lncRNA，其中上调472条，下调126条。RT-qPCR验证了MIR4435-2HG、SH3PXD2A-AS1、Lnc00668、MIR194-2HG、AC245060.6、BX890604.2等共6个基因。查阅文献挑选出3条在肠息肉组织中表达上调的，且3条在肠息肉组织表达下调的lncRNAs分布为MIR4435-2HG、SH3PXD2A-AS1、LINC00668、MIR194-2HG、AC245060.6、BX890604.2，6条lncRNAs筛选标准为:(1)差异表达倍数>2,(2)P<0.05,(3)已知基因名(gene symbol)的lncRNA，(4)生物学信息软件预测有顺式作用(Cis)调控的靶基因。应用RT-qPCR方法进行验证，两组标本各基因相对表达量比较见表4、图2。

表4 两组标本中差异表达的lncRNAs比较

3 讨 论

随着基因组学和转录组测序技术的迅速发展发现只有不足2%左右的基因具有编码功能，大多数基因转录出来的产物是非编码RNA(non-coding RNA，ncRNA)[7]。当前lncRNA的发现主要来源于微阵列技术、第2代高通量转录组测序技术、单细胞测序技术等。如今，随着大型lncRNA文库的建立，以及新一代高通量测序技术的全方位应用和芯片技术的改良发展，必将继续有大量lncRNA被筛选鉴定出来[8]。

随着研究的深入，越来越多的数据表明，人类许多疾病的发生、发展均与lncRNA表达异常密切相关，如lncRNA在许多恶性肿瘤中的表达都与在正常组织中有很大差异。肺腺癌相关转录本1是第一个在肺癌中被研究的lncRNA,其在肺癌中具有很高的表达特异性，被认为是非小细胞肺癌，尤其是肺腺癌早期转移阶段的特异性标志物[9]。据文献报道，胃癌中存在许多上调的异常表达的lncRNA，如CCAT1、HULC、H19等[10]，YARANI等[11]在一项克罗恩病(CD)、溃疡性结肠炎(UC)及正常结肠对照组织中的测序发现与正常对照组比较，CDKN2B-AS1 lncRNA在CD患者中表达下调了4.9倍(P=0.041)，而在UC中下调了12倍(P=0.000 9)。这项发现在其他研究中也得到了证实[12]。有学者通过定量逆转录聚合酶链反应分析发现，急性心肌梗死患者全血中锌指结构反义转录本1水平(0.74±0.07)显著低于非心肌梗死患者和健康志愿者，故将其称为心脏特异性或心脏相关的lncRNA[13]。

目前，尚未见lncRNA与儿童肠息肉的文献报道，本研究利用高通量测序技术对3对儿童肠息肉组织及配对的正常肠黏膜组织，加4例儿童肠息肉，共计10例标本进行检测和生物学分析发现了1 307+738条差异表达的mRNA(肠息肉组织和正常肠黏膜组织差异表达2倍以上)，而lncRNA差异表达明显者598条，其中上调472条，下调126条。进一步筛选出在每个样本中均有表达且差异最明显的lncRNA,为此挑选了MIR4435-2HG、SH3PXD2A-AS1、LINC00668、MIR194-2HG、AC245060.6、BX890604.2进行验证，结果表明测序结果准确，为后续研究lncRNA在儿童肠息肉中的生物学功能奠定了基础。GO和KEGG分析提示差异表达的lncRNA主要涉及信号传导、免疫系统、内分泌系统、消化系统及癌症等相关过程，提示其可能与儿童肠息肉的生物特征有关。

lncRNA——MIR4435-2HG也称为AK001796和lnc00978，编码在人类染色体2Q13上。作为一种癌基因，MIR4435-2HG最初的特征是参与了肺癌细胞生长抑制[14]。随后研究发现MIR4435-2HG的表达与乳腺癌患者的不良预后呈正相关[15]。另一方面，最近研究表明MIR4435-2HG可促进胃癌(Gastric Cancer,GC)生长，并提示其可作为GC诊断标记物的相关性[16-17]。作者已在体外实验中对于lncRNA MIR4435-2HG进行了相关细胞株的进一步研究。

SH3PXD2A-AS1在大肠癌中发挥致癌作用已有文献报道[18]，但对其在大肠癌中的作用和机制研究的文献报道甚少见。因此，GUO等[19]研究了SH3PXD2A-AS1对大肠癌细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡以及肿瘤生长的影响，其利用miRDB和miRTarBase数据库筛选出miR-330-5p和UBA2，构建了SH3PXD2A-AS1/miR-330-5p/UBA2 CERNA调控网络，并检测了SH3PXD2A-AS1/miR-330-5p/UBA2网络在大肠癌细胞生长和存活中的作用，认为SH3PXD2A-AS1可作为大肠癌治疗的潜在生物标志物。

已有研究证明lnc00668是几种癌症的致癌基因，如非小细胞肺癌[20]和胃癌[21]。 此外，有学者发现lnc00668在肿瘤组织样品和癌细胞系中显著升高，lnc00668通过与miR-532-5p结合促进原发性肝细胞癌的发生[22]。

最新的高通量测序的转录组分析显示，lncRNA——MIR194-2HG在膀胱癌中被下调[23]。XU等[24]评估了在肝癌组织和肝癌细胞系中不经常研究的lncRNA——MIR194-2HG的表达，并研究了其作用和分子机制。认为MIR194-2HG通过激活Wnt/β-联蛋白信号通路在HepG2和Huh7细胞中发挥致癌作用。此外，其还证明了MIR194-2HG与miR-1207-5p/TCF19轴相互作用，从而消除了miR-1207-5p对TCF19的抑制作用，表明MIR194-2HG可能是肝癌的新型诊断标记物或治疗靶标。

本研究的局限性是由于儿童的特殊性，初始所得测序样本量较小，存在一定的研究偏倚，数据只能作为初步参考，后期将继续扩大样本量进行研究。但本研究所揭示的lncRNA在儿童肠息肉中的差异表达可能为儿童肠息肉的发病机制研究带来新的思路，并可能为疾病诊治提供新的线索和潜在的干预靶标。