牦牛血清对H9c2细胞增殖及衰老的影响*

白玉婷，格日力，王立生，苏晓灵△

(1.青海省人民医院心血管内科，西宁 810001；2.青海大学医学院高原医学研究中心，西宁 810001；3.青岛大学附属医院医学研究中心分子诊断与再生医学科，山东青岛 266000)

胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)是一种广泛用于非计数型原代细胞和永生化细胞培养的具有代表性的添加剂。FBS的精确组成成分尚不清楚，因为这种添加剂包含各种未知的天然小分子和比例不同的蛋白质(批次之间成分变化)。牦牛是一种生存于海拔3 500 m以上的野生牛种，是青藏高原及中国周边地区的标志[1]。牦牛可以充分利用其他牲畜难以利用的高山草原，并为高海拔居民提供了必要的资源，是高海拔居民生存的手段[2]。牦牛与低海拔牛在解剖学和生理学方面有许多不同之处，除通过消除低氧导致的血管收缩而生活在高海拔地区外[3]，其心肺增大、缺氧性肺血管收缩不足、觅食能力增强、能量代谢增加使其能更好适应高海拔地区。牦牛作为理解适应的分子基础模型动物，其最小生物信息学在整个基因组测序之前便已完成[4]，但牦牛的非正常存活生物学机制及其对高原氧化应激的反应机制目前尚不清楚[5],其对细胞的增殖及衰老有何影响至今少见相关文献报道。本研究通过与其他品种FBS进行比较，研究了牦牛血清对胚胎大鼠心肌细胞(H9c2细胞)生长、增殖及衰老的影响，以期找到H9c2细胞生长更相适应的血清。

1 材料与方法

1.1材料

H9c2由中国人民解放军军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所传代保存。试剂为杜氏改良Eagle培养基(DMEM)培养液、二甲亚砜、CCK8试剂、血清(四季青、Hyclone)等。

1.2方法

1.2.1H9c2细胞培养

使用含10%牦牛血清、Hyclone血清、四季青血清加DMEM培养液培养H9c2细胞，置于37 ℃、5% CO2的培养箱，每2天更换1次培养基，待细胞长至对数生长期时进行试验。

1.2.2牦牛血清的制备

取静脉血，室温下静置1 h，2 500 r/min离心15 min，分离血清，并经0.22 μm滤膜滤过，30 min水浴灭活。

1.2.3细胞计数法

取待测细胞和对照细胞悬液各10 μL，滴于细胞计数板上，在低倍镜下计数4个大方格内的细胞。边缘压线细胞以数上不数下，数左不数右的原则进行。

1.2.4H9c2细胞增殖检测

将H9c2细胞以5×103细胞/mL密度(100 μL)接种于96孔板中，每组5个复孔，37 ℃、5% CO2培养箱培养24、48、72 h。培养结束前每孔加入10 μL CCK8，37 ℃避光孵育2 h后用酶联免疫检测仪在450 nm波长处测定吸光度(A)值。

1.2.5q-PCR测定

用Trizol法提取总RNA，逆转录获取cDNA，配置好q-PCR反应液后以4副孔加样，瞬时离心去气泡后采用ABI 7500 FAST q-PCR仪进行标准PCR扩增程序：50 ℃ 20 s，95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min。

1.3统计学处理

2 结 果

2.1不同血清对H9c2细胞生长的影响

牦牛血清培养细胞的细胞数在第2～6天均显著高于四季青血清，在第2天显著高于Hyclone血清，差异均有统计学意义(P<0.05)；其他时间点比较，差异均无统计学意义(P>0.05)；Hyclone血清培养细胞的细胞数在第3、4、5、6天均显著高于四季青血清，差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 3种血清对H9c2细胞生长的影响

2.2不同血清对H9c2细胞增殖的影响

牦牛血清培养细胞的细胞倍增数在第24、48、72、96、120小时均显著高于Hyclone血清和四季青血清，Hyclone血清培养细胞的细胞倍增数在第24小时显著高于四季青血清(P<0.05)，其余时间点比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 3种血清对H9c2细胞增殖的影响

2.3不同血清对H9c2细胞p21、p16、p38、p53表达的影响

四季青血清p21、p53表达均显著高于牦牛血清和Hyclone血清，差异均有统计学意义(P<0.05)。3种血清p16、p38 mRNA表达比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 3种血清对H9c2细胞p21、p16、p38、p53表达的影响

3 讨 论

血清是从牛胎血液中所获得的体外培养基的常见补充物，包含生长因子、激素、维生素、氨基酸、脂肪酸和细胞生长所需的微量元素，因此，早期即被引入细胞生物学研究中[6]。血清作为真核细胞体外培养的补充物，在心肌细胞生长、繁殖过程中发挥着重要作用。不同血清对心肌细胞的生长影响不同，因此，找到与H9c2细胞生长相适应的血清显得尤为重要。

牦牛能很好地适应高寒草原环境，在空气稀薄、温度低、紫外线强、草短等恶劣高原环境下自由生活和繁殖[7]。据文献报道，牦牛血中的低聚肽抗氧化能力及脂质过氧化抑制能力均显著优于商品化大豆低聚肽，且牦牛血低聚肽还可缓解缺氧导致的机体应激损伤，具有潜在药用价值[8]。但在以往，牦牛血未能得到良好的利用及研究，本研究通过比较3种不同品种FBS对H9c2细胞生长及增殖发现，H9c2细胞在含有牦牛血清的培养基中生长状态良好，细胞活力好，增殖倍数优于Hyclone血清和四季青血清，提示与Hyclone血清和四季青血清比较，H9c2细胞可能更适应于在牦牛血清中生长。

衰老是细胞、组织和器官结构和功能渐进性恶化的生物过程，细胞衰老的典型特征是不可逆的细胞周期阻滞，可能由DNA损伤、氧化应激、营养剥夺、致癌损伤或化疗毒性引起[9]。目前有研究表明，细胞衰老具有两面性，一方面在衰老过程中衰老细胞在各种组织中积累，导致发生许多与年龄相关的疾病，如动脉粥样硬化、癌症、肝脂肪变性、阿尔茨海默病、纤维化肺病和骨关节炎[9-12]，而消除这些衰老细胞可以延长寿命[13]。另一方面衰老细胞在胚胎发育、肿瘤抑制、伤口愈合和组织修复等过程中发挥着多种有益作用[14]。细胞增殖和衰老是一个复杂的过程，涉及多种细胞成分和信号通路，其中p21、p53肿瘤抑制基因家族是与衰老相关的最具特征性的因素[15]，而p16是由大多数衰老细胞表达的用于鉴定衰老的关键标记物[16]。p38作为一种有丝分裂原激活的蛋白激酶，可被外界信号和炎性细胞因子激活，参与细胞增殖、分化、迁移、衰老和凋亡等多种细胞生物学过程[17]。因此，本研究通过检测上述指标发现，与牦牛血清和Hyclone血清比较，四季青血清H9c2细胞p21、p53表达最高，而p38、p16表达无明显差异，提示p21、p53过度表达可能导致H9c2细胞衰老进而影响H9c2细胞的生长和增殖。而LPEZ-OTN等[18]和MUNOZ-ESPIN等[19]研究也表明，在衰老细胞中不可逆细胞周期阻滞主要是由细胞周期抑制剂——p16、p21、p53上调所致。然而，牦牛血清与其他血清的不同之处及其如何影响细胞生长、增殖及衰老尚需进一步深入研究。