超高效液相色谱-串联质谱法测定蜂蜜中氯霉素及硝基咪唑类药物残留

倪杨 杨军军 石磊 张莹莹 熊融

（北京市农林科学院林业果树研究所，北京市落叶果树工程技术研究中心，农业农村部果品及苗木质量监督检验测试中心（北京），北京 100093）

氯霉素（Chloramphenicol，CAP）是酰氨醇类抗生素，对革兰氏阴性菌以及阳性菌都有很好抑制作用，常用于动物传染性疾病的预防治疗，由于其药性稳定且价格低廉，在蜂业养殖中常被非法使用，导致消费者可能长期低剂量摄入而危害健康，蜂蜜中CAP 残留问题是影响蜂蜜食用安全和贸易的主要问题之一[1-3]。CAP 在人体内过量蓄积能够抑制骨髓造血功能，导致再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、灰婴综合征等疾病，还可引起中枢或外周神经系统疾病，甚至诱使细胞癌变[4-6]。因此，世界上许多国家已禁止CAP 类药物用于动物食品的生产，美国规定在动物性食品中不得检出CAP，欧盟规定CAP 等多种抗生素药物不再作为兽药使用，我国在2002年已将CAP 列入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》（中华人民共和国农业部公告第193 号）。

硝基咪唑类（nitroimidazoles，NMZs）药物是一类具有5-硝基咪唑环共同结构的合成抗菌类药物，具有抗原虫和抗厌氧菌活性，曾被广泛用于蜜蜂孢子虫病的预防和治疗，造成该类药物在蜂蜜中的残留问题[7]。由于NMZs及其在生物体内的代谢产物具有潜在致癌性、致畸性和致突变性，且代谢物在动物体内比原药维持时间更长[8]，如果在动物源性食品中残留、累积，则会对食品安全构成严重威胁[9-10]。因此许多国家将NMZs 列为违禁药物，我国已于2002年禁止NMZs 的使用，GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》明确规定，除二甲硝咪唑和甲硝唑允许用于治疗，不得在动物性食品中检出，其他NMZs 在所有食品动物中禁止使用，且不得检出[11]。

鉴于抗生素的危害，国家监管机构曾加大对CAP、NMZs 等药物残留问题的监督，但非法使用现象仍屡禁不止，蜂蜜抽检不合格的事件时有发生[12-15]，因此有必要建立蜂蜜中CAP 和NMZs 的精准定量检测方法。目前，高效液相色谱法、超高效液相色谱法作为主流色谱技术的代表，尤其与质谱技术联用，凭借强大的分离能力和较好的灵敏度、准确性，已经发展成为药物检测领域最为可靠的定性定量分析方法。但农产品中CAP、NMZs 的液质检测方法，前处理多使用固相萃取柱[2、11、16-17]进行净化，不但其选择性和除杂富集效果有待提高，因其操作复杂、过柱时间长且成本较高，不适合大批量快速检测。QuEChERS 作为一项新兴的高效提取净化方法，因其操作简单、适用性广、提取净化效率高等优点，广泛应用于兽药检测之中。本研究综合利用QuEChERS 方法和UPLCMS/MS 技术的优势，建立了UPLC-MS/MS 同时检测蜂蜜中CAP 和NMZs 残留量的方法，具有灵敏、简便、高效的优点，可满足蜂蜜中多组分抗生素药物残留的监测需求。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蜂蜜样品：购于超市和集市，于-20℃保存；标准品：CAP、甲硝唑（Metronidazole，MNZ）、羟基甲硝唑（Metronidazole-OH，MNZOH）、二甲硝咪唑（Dimetridazole，DMZ）、羟基二甲硝咪唑（Hydroxydimetridazole，HMMNI）、异丙硝唑（Ipronidazole，IPZ）、羟基异丙硝唑（Ipronidazole-OH，IPZOH）、洛硝哒唑（Ronidazole，RNZ）纯度＞98%，北京曼哈格生物科技有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯） 美国Fisher 公司；甲酸、乙酸铵、氯化钠、无水硫酸镁、无水硫酸钠（分析纯）上海麦克林生化科技有限公司；PSA、C18日本岛津公司；微孔过滤膜（13 mm×0.22 μm，尼龙） 北京迪科马科技有限公司；Acquity BEH C18色谱柱（2.1×100 mm，1.7 μm） 美国Waters 公司；ACQUITY HSS T3 色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.8 μm） 美国Waters 公司；ACQUITY BEH HILIC色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）美国Waters 公司；氩气（纯度＞99.9%） 北京氦普北分气体工业有限公司；实验用水为超纯水（电阻率大于18.2 MΩ·cm） 由Milli-Q 超纯水机制备。

1.2 仪器与设备

ACQUITY UPLC I-Class 液相色谱仪 美国Waters公司；Xevo TQ-S 质谱仪（配有ESI 及Masslynx4.1 数据处理系统） 美国Waters 公司；Milli-Q 超纯水机美国Millipore 公司；GL-20G-II 高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂；FE20 型实验室pH 计梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KQ-600DB 超声波清洗器 昆山市超声波仪器有限公司；QL-8BB 旋涡混合器 海门市其林贝尔仪器制造有限公司；BSA224SCW 型电子天平 德国Sartorius 公司；PL2002 电子天平 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 标准溶液配制

标准储备液：准确称取10 mg（精确到0.1 mg）标准品于10 mL 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度线得到1000 μg/mL 的单标储备液，于-20 ℃冰箱中密封、避光保存。

标准中间液：精密吸取单标储备液0.1 mL 于10 mL棕色容量瓶中，加入甲醇定容至刻度线得到10 μg/mL的标准中间液，4 ℃密封、避光保存。

混合标准溶液：精密吸取标准中间液各0.05 mL 于10 mL 容量瓶中，加入甲醇定容至刻度线得到50 μg/L的混合标准溶液，现配现用。

基质混合标准溶液：精密吸取标准中间液0.02 mL于PE管中氮吹至近干，加入2 mL甲醇至浓度为100 g/L。用空白基质溶液逐级稀释，配制不同质量浓度的系列混合标准工作液，现用现配。其中，CAP、MNZ、DMZ、IPZ、RNZ 的标准工作曲线浓度分别为0.1、1、5、10、20、50 μg/L，MNZOH、HMMNI、IPZOH 的标准工作曲线浓度分别为0.5、1、5、10、20、50 μg/L。1.3.2 样品前处理

将蜂蜜样品搅拌均匀，称取5.00 g 置于50 mL 旋盖离心管中，加入5 mL 超纯水涡旋振荡溶解，再加入15 mL 乙腈溶液超声提取10 min，然后加入3 g 氯化钠，涡旋振荡1 min 后静置分层。吸取3 mL 有机相置于内含200 mg C18和200 mg PSA 的15 mL 离心管中，涡旋振荡0.5 min 后，静止3 min，过0.22 μm 有机滤膜于样品瓶中，待测分析。

1.3.3 色谱条件

色谱柱：Acquity BEH C18（2.1×100 mm，1.7μm）；柱温：40℃；流速：0.2 mL/min；流动相：A 为乙腈，B 为0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸铵水溶液；梯度洗脱程序：0～0.5 min、90% B，0.5～1.0 min、90%～40% B，1.0～3.0 min、40%～10% B，3.0～4.0 min、10% B，4.0～4.5 min、90% B；进样量：2 μL。

1.3.4 质谱条件

离子源：ESI；扫描方式：正、负离子同时扫描；检测模式：MRM；毛细管电压：2.5 kV；离子源温度：150 ℃；锥孔电压：40 V；脱溶剂气温度：350 ℃；脱溶剂气流量：650 L/h；碰撞气：氩气。

1.4 数据分析

通过Waters Masslynx 仪器配置工作站系统进行数据采集，利用Excel 软件、R 语言进行数据分析及图形绘制。

2 结果与分析

2.1 质谱条件的优化

混合标准工作液直接进样进行正负离子扫描，CAP 在负离子[M-H]-模式响应最高，且得到的碎片离子信息最强。7 种NMZs 在正离子[M+H]+模式下响应值最高，增加碰撞能量和锥孔电压，获得离子碎片信息。选择相对较强的2 个离子作为定量和定性离子对，最后优化裂解电压、碰撞能量使目标化合物响应值达到最大，最终离子对、裂解电压、碰撞能量等优化参数如表1所示。

表1 质谱参数

2.2 色谱条件的优化

比较了CQUITY BEH C18柱、ACQUITY HSS T3柱和ACQUITY BEH HILIC 柱的灵敏度和分离效率，结果发现HSS T3 色谱柱不能很好地分离NMZs，会产生连续的色谱峰；使用BEH HILIC 色谱柱时，部分化合物不出峰，且整体峰形较差，响应值较低；而BEH C18色谱柱能够在3 min 内较好的分离8 种化合物，且峰型更加对称、尖锐，灵敏度更高，故选定CQUITY BEH C18柱作为分析色谱柱。

为了获得最佳的色谱分离效果以及提高目标化合物的灵敏度，实验对流动相进行优化。甲醇和乙腈是色谱检测中常用的有机系流动相，研究比较了甲醇-水、乙腈-水作为流动相的效果，发现乙腈作为流动相时，目标化合物的出峰时间适中、峰宽较小、响应值较高。由于降低流动相pH 值可以改善峰形、提高质谱离子化效率，实验选用0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸铵水溶液作为水相，通过优化梯度洗脱程序，在流速0.2 mL/min，柱温40 ℃条件下，各化合物峰形对称性明显得到改善，并且响应值增强，色谱条件优化后的MRM色谱图如图1所示。

图1 MRM色谱图

2.3 提取条件的优化

由于蜂蜜不易溶于有机溶剂，因此通常用纯水溶解蜂蜜样品。甲醇、乙腈是目前最常用的提取剂[18]，甲醇比乙腈具有更好的溶解性，易将样品中的糖、酸、色素、蛋白质等物质提取出来，致使提取液中杂质较多，不利于后续的盐析和净化，而乙腈对蛋白的沉淀作用较强且共提物少，因此选择乙腈作为提取剂。

提取过程中加入无机盐可以促进目标化合物由水相分配至有机相，利于水相与有机相分层。实验对比NaCl、无水MgSO4、无水Na2SO4对8 种兽药回收率的影响。结果发现，添加3 g NaCl，涡旋振荡1 min 后静置，即可使两相溶液分层完全、清透，且对目标化合物的回收率最好。

在目标物提取过程中，蜂蜜中的糖、酸、色素等组分也会被部分提取，不仅影响痕量目标物的检测，也会对色谱、质谱系统造成污染，为降低基质效应，需要对提取液进行净化除杂。QuEChERS 方法常用的净化剂以C18、PSA 为主，C18可有效除去脂肪和脂类等非极性有机物，PSA 能够吸附多种极性有机酸、极性色素以及部分糖类和脂肪酸，动物源性食品基质较为复杂，为获得理想的净化效果，本方法同时使用C18、PSA 2 种吸附剂。实验以空白蜂蜜样品的加标回收实验，比较了不同比例吸附剂混用对8 种兽药净化回收的影响（n=3）。通过对2 种吸附剂的用量配比进行正交试验优化，C18和PSA 2 个因素各取3 个水平（100 mg、200 mg、300 mg），比较50 μg/L 加标水平下各因素组合的回收率来选择最佳配比组合。正交试验因素见表2，结果表明，使用200 mg C18和200 mg PSA 组成净化剂可以获得良好的回收效果，回收率为88.6%～95.3%。

表2 C18、PSA用量配比的正交试验因素水平

2.4 方法学评价

2.4.1 基质效应

为评价基质效应，以基质标与溶剂标曲线斜率的比值考察8 种兽药在蜂蜜中的信号增强/抑制程度（signal suppression/enhancement,SSE），SSE值大于1.2表示基质增强效应，小于0.8 表示基质抑制效应，在0.8～1.2 之间则视为基质效应影响不大。由表3得知，在蜂蜜基质中，所有化合物的SSE 值均低于1.2，但MNZOH、DMZ 和IPZOH 的SSE 值在1.15～1.20 范围内，属于弱增强效应，因此，采用基质匹配标样来对蜂蜜中的目标化合物进行定性和定量分析。

表3 基质效应

2.4.2 线性关系、LODs 与LOQs

取空白蜂蜜样品，按照1.3.2 进行样品前处理，分别配制一系列浓度的基质混合标准工作液，上机测定后，以色谱峰面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），绘制8 种兽药的基质标准曲线，并以定性通道的3 倍信噪比（S/N=3）、定量通道的10 倍信噪比（S/N=10）确定各化合物的LODs 和LOQs。结果表明，目标化合物在各自质量浓度范围内，峰面积与质量浓度呈现良好线性关系（R2≥0.9986），LODs和LOQs 分别为0.09～1.50 μg/kg、0.20～3.00 μg/kg，本方法具有良好的定性和定量分析能力。

2.4.3 回收率与精密度

空白蜂蜜样品中添加3 个浓度水平（LOQ、3×LOQ、10×LOQ）的目标化合物，每个浓度做6 个平行样，以本文上述方法处理样品并测定浓度，计算加标回收率和RSDs。回收率指在蜂蜜空白样品添加一定质量浓度的标准品后再进行前处理，用空白样品提取液配制的基质匹配标准溶液，计算回收率；精密度是测定蜂蜜样品3 个添加水平6 个重复的回收率，以RSD 表示。结果见表5，8 种兽药在低水平添加量下的平均回收率为81.2%～92.3%，RSDs 为2.2%～4.2%；中水平添加量下的平均回收率为83.6%～93.3%，RSDs 为1.2%～4.1%；高水平添加量下的平均回收率为88.8%～95.5%，RSDs为2.0%～3.6%。检测结果满足GB/T 27404-2008《实验室质量控制规范 食品理化检测》的相关要求。

表5 回收率和RSDs（n=6）

2.5 实际样品测定

为验证本方法的适用性，选取超市蜂蜜样品10份、蜂农自产自销蜂蜜样品5 份进行分析。其中，超市售卖的蜂蜜中，有1 份样品检出MNZ，含量为0.86 μg/kg；而蜂农销售的蜂蜜中，有2 份样品只检出MNZ，含量为1.17 μg/kg、2.83 μg/kg，1 份样品同时检出CAP 和MNZ，含量分别为1.47 μg/kg 和5.36 μg/kg。根据GB 31650-2019《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》规定，CAP 和MNZ 不得在动物性食品中检出，本次抽检结果应给予持续关注。

表4 线性范围、线性方程、相关系数、LODs和LOQs（n=6）

3 结论

本研究建立了UPLC-MS/MS 同时测定蜂蜜中CAP 和NMZs 的快速检测方法。实验优化了前处理方法及色谱质谱条件，使目标化合物拥有较好的分离效果和较高的检测灵敏度。样品以ACQUITY BEH C18色谱柱分离，在ESI 正、负离子切换扫描模式下，采用MRM 模式测定，8 种兽药在3 min 内完成色谱分离分析。在0.1～50 μg/L 质量浓度范围内，8 种兽药在蜂蜜中均呈现良好线性关系（R2≥0.9986），其中CAP 的LOD、LOQ 分别为0.09 μg/kg 和0.20 μg/kg，7 种NMZs 的LODs 和LOQs 分别为0.50～1.50 μg/kg 和1.50～3.00 μg/kg。以蜂蜜基质分别在低、中、高3 个添加水平下进行加标回收实验，平均回收率为81.2%～95.5%，RSDs 为1.2%～4.2%，满足检测方法确认的相关要求。该方法操作简单、精密度好、灵敏度高、分析速度快，可广泛应用于蜂蜜中CAP 和NMZs 的测定，为监测、评估蜂蜜中多组分兽药的污染风险评估和确证检测提供参考方法。