独活寄生汤调节淋巴系统防治类风湿关节炎

郑为超,王 岚，方 叶，尤佳锋，梁倩倩

(1.安徽理工大学医学院，安徽 淮南 232001；2.上海市中医药研究院脊柱病研究所，上海 200032；3.上海中医药大学附属龙华医院，上海 200032)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是一种自身免疫性疾病，受累关节处疼痛并伴有畸形，给家庭和社会带来沉重负担[1]。炎症水平与RA的发生、发展及预后密切相关，因此控制炎症是防治RA的关键环节[2]。目前控制RA炎症水平的常用药物包括非甾体抗炎药、糖皮质激素，但副作用明显，价格昂贵，难以长期服用。因此，寻找简便廉效的治疗药物已成为亟待解决的重要问题[3]。

淋巴系统具有回流炎症物质[4]和调节免疫的重要作用[5]。促进淋巴管新生，可以保持组织液渗透压的平衡，加速局部水肿消退，回流聚集的炎症因子可减轻炎症反应[6]。文献[7]研究发现，关节内注射(血管内皮生长因子-C，VEGF-C)可增加淋巴管新生，改善炎症性关节的淋巴回流，减轻关节炎症。TNF-Tg小鼠腹腔内注射(血管内皮生长因子R-3，VEGF-R3)中和性抗体抑制淋巴回流，会加重关节炎症[8]；应用炎症信号通路抑制剂，可以改善关节疼痛情况[9]，但影响淋巴回流减轻炎症的机制尚不明确。免疫系统内M1型巨噬细胞分泌的促炎因子和趋化因子可导致RA的慢性滑膜炎症[10]。因此，通过调控淋巴管系统，促进淋巴管新生和抑制M1型巨噬细胞，从而抑制炎症反应，可能是防治RA的潜在靶点。

独活寄生汤出自《备急千金药方》，具有补血益气、驱邪扶正之功效，是临床上防治RA的经典方剂，对治疗RA的效果显著，在临床上已被广泛应用[11]。独活寄生汤能否通过促进淋巴管回流和抑制M1型巨噬细胞，抑制关节滑膜炎症防治RA尚不清楚。因此本研究以TNF-Tg小鼠建立炎症性关节病模型，从淋巴管系统角度探讨独活寄生汤防治RA的药效与药理研究，以期为中医药调节淋巴系统防治类风湿关节炎提供新思路。

1 材料

1.1 动物

本实验所用TNF-Tg小鼠由G.Kollias博士赠与，并与C57BL/6小鼠回交以保持杂合子，这一品系的TNF-Tg小鼠携带一份人类TNF转基因表型，并发展出一种与类风湿关节炎(RA)非常相似的疾病，其特征是自发的、慢性的、进行性的炎症性侵蚀性关节疾病，小鼠交予上海南方模式动物公司饲养繁育(SPF级，自由饮水摄食)。动物合格证号：SCXK(沪)2017-0010。动物操作过程符合国际、国内相关生物医学研究伦理规范，做到善待动物，防止或减少动物的应激、痛苦和伤害。

1.2 仪器

ASP300s全自动组织脱水机，德国LEICA公司；EG1150C石蜡包埋机，德国LEICA公司；HI1210组织展片机，德国LEICA公司；RM2135石蜡切片机，德国LEICA公司；VS120-SL全片扫描仪，日本OLYMPUS公司

1.3 药物

独活寄生汤药物组成包括：独活9g、桑寄生6g、杜仲6g、牛膝6g、细辛6g、秦艽6g、茯苓6g、肉桂6g、防风6g、川芎6g、人参6g、甘草6g、当归6g、芍药6g、地黄6g。所有中药均购自上海中医药大学附属龙华医院中药房。将中药煎煮浓缩成1.2kg/L，储存于-20℃保存。

1.4 试剂

焰红燃料B(Phloxine B，sigma，P2759-25G)，无水冰醋酸(国药集团化学试剂有限公司，10018818),橙黄G(Orange G，O3756-25G),苏木精(Hematoxylin，sigma，H3136-25G),阿尔新蓝(Alcian blue 8GX，sigma，A5268),伊红(Eosin Y，sigma，E4009-5G),中性树胶(中国上海标本模型厂),胰蛋白酶抗原修复液(雷根生物，IH0310)，抗淋巴内皮透明质酸抗体(Abcam,ab14917),抗平足蛋白抗体(Abcam，ab11936)，Alexa Fluor® 488荧光Anti-F4/80抗体(Abcam，ab204266)，重组Alexa Fluor® 647荧光Anti-iNOS抗体(Abcam,ab209027)，Anti-rat IgG(H+L)，(cell signaling，#4417s)，Anti-rabbit IgG (H+L),(cell signaling，#4412s)，免疫荧光封片剂(vector vectashield，H1200)

2 方法

2.1 分组及给药

3月龄TNF-Tg转基因小鼠10只用作RA动物模型，将小鼠随机分为TNF-Tg组和DHJST治疗组，5只/组，另取5只同窝生野生型小鼠作为Control组。根据《实验动物药理学》，将小鼠(20g)与人(70kg)的中药剂量进行换算(换算系数9.01)，独活寄生汤组以12g/kg；对照组与模型组给予相同体积的生理盐水，每天灌胃1次，连续12周。

2.2 标本处理

小鼠连续给药3个月后采用放血法将小鼠处死，取完整踝关节，将标本置于10%福尔马林固定液中24h，清水冲洗30min，14%EDTA脱钙4周，每2d更换脱钙液，取出踝关节，流水冲洗2h将组织脱水后，石蜡包埋，4μm连续切片。

2.3 踝关节组织形态学检测

取石蜡标本进行阿尔新蓝-苏木精形态学染色(ABOG染色)，石蜡切片脱蜡至水，阿尔新蓝-苏木精浸染40min，2%盐酸乙醇分化5s，0.5%氨水返蓝15s，水洗，橙红染液浸染1min，不水洗后乙醇梯度脱水至透明，二甲苯透片，中性树胶封片。VS120全片扫描仪扫描，观察踝关节组织形态结构变化。

2.4 M1型巨噬细胞免疫荧光染色

石蜡切片脱蜡至水；37℃胰蛋白酶抗原修复15min，水洗3遍，4%BSA室温封闭60min，一抗(F4/80)1∶400，一抗(iNOS)1∶200比例稀释混合，4℃避光孵育过夜，BSA浸洗3次，荧光封片剂封片，即刻VS120全片扫描仪(荧光模式)扫描，观察踝关节周围M1型巨噬细胞分布情况。

2.5 淋巴管免疫荧光染色

石蜡切片脱蜡至水；37℃胰蛋白酶抗原修复15min，水洗3遍，4%BSA室温封闭60min，一抗(LYVE-1和Podoplanin)均以1∶500比例稀释混合，4℃孵育过夜，PBS浸洗3遍；二抗1∶400避光孵育1h，PBS洗3遍；荧光封片剂封片，即刻VS120全片扫描仪(荧光模式)扫描，观察踝关节淋巴管分布情况。

2.6 统计学方法

用SPSS 19.0统计软件分析，统计结果采用平均值±标准差进行描述，多组间比较采用单因素方差分析(oneway ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。散点图由GraphPad Prism 8绘制完成。

3 结果与分析

3.1 独活寄生汤对TNF-Tg小鼠骨与软骨影响

ABOG染色结果显示，Control组距骨形态完整，软骨表面光滑且连续，TNF-Tg组距骨形态和软骨结构均被破坏， DHJST组距骨形态和软骨有一定程度恢复， 如图1(a)所示。在软骨结构方面，与Control组比较，TNF-Tg组小鼠踝关节软骨减少(P<0.01)；与TNF-Tg组对比， DHJST组软骨结构有所恢复(P<0.01)， 如图1(b)所示。 骨形态方面， 与Control组比较， TNF-Tg组距骨侵蚀严重， 形态和完整性被破坏(P<0.01)； 与TNF-Tg组比较， DHJST组踝关节距骨形态及完整性有一定程度恢复(P<0.05)，如图1(c)所示。组织炎症浸润分析显示,与Control组相比，TNF-Tg组炎症浸润面积显著增加(P<0.01)；与TNF-Tg组比较，DHJST组炎症浸润面积减少(P<0.01)，如图1(d)所示。

(a)小鼠踝关节ABOG染色图

3.2 独活寄生汤对TNF-Tg小鼠淋巴管影响

抗淋巴内皮透明质酸抗体(Anti-LYVE-1)和抗平足蛋白抗体(Anti-Podoplanin)双染则表示毛细淋巴管，抗平足蛋白抗体(Anti-Podoplanin)单染则为集合淋巴管，如图2(a)所示。淋巴管免疫荧光染色结果显示，与Control组比较，TNF-Tg组毛细淋巴管生成增加(P<0.01)，集合淋巴管覆盖面积增多(P<0.01)；与TNF-Tg组比较，DHJST组毛细淋巴管显著增多(P<0.01)，集合淋巴管覆盖面积更广(P<0.01)，如图2(b)～(c)所示。

(a)小鼠踝关节淋巴管免疫荧光染色图

3.3 独活寄生汤对TNF-Tg小鼠巨噬细胞影响

Anti-F4/80抗体和Anti-iNOS抗体双染所示M1型巨噬细胞，如图3(a)所示。组织免疫荧光染色结果显示，与Control组比较，TNF-Tg组M1型巨噬细胞染色面积增大，细胞数量增多，炎症在关节处浸润情况严重(P<0.01)；与TNF-Tg组相比，DHJST组M1型巨噬细胞减少，炎症在关节的浸润情况改善(P<0.01)，如图3(b)所示。

(a)小鼠踝关节巨噬细胞免疫荧光染色图

4 讨论

RA在中医属“痹证”范畴，痹即有闭阻不通之意。中医中“痹症”不通则痛的特点与淋巴回流功能受阻导致关节炎的症状极为相似。中医认为，引起RA发病的机理是由于正气不足，风、寒、湿、暑等外邪侵入人体使脏腑功能失调，加上气血不足导致体质虚弱，从而引起皮肉不坚而痹症发[12]。独活寄生汤出自唐代孙思邈的《备急千金要方》，是中医临床治疗RA的经典方[13]，具有祛风湿、止痹痛、益肝肾、补气的功效。前期研究发现，独活寄生汤可以降低RA大鼠体内白细胞介素-1(IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等炎症因子水平，缓解炎症情况[14]。

本研究采用TNF-α转基因(TNF-Tg)小鼠模型，观察独活寄生汤对RA炎症免疫反应及淋巴回流功能的影响。本实验ABOG染色结果显示，TNF-Tg小鼠软骨及骨侵蚀严重，炎症浸软面积增大，DHJST组软骨结构有所恢复，炎症面积减少，说明独活寄生汤干预后可逆转TNF-Tg小鼠骨及软骨形态，减轻炎症浸润，减缓类风湿关节炎进程。

RA的发生发展伴有关节组织损伤、强烈的炎症免疫反应及淋巴循环功能障碍。炎症初始阶段，外周和引流淋巴结之间通过扩张的淋巴管网和分子运输功能，代偿调节炎症反应程度，保护机体免受严重损伤[8]。随着病程的进一步发展，大量炎症因子聚集在受累关节处，使得淋巴管的收缩功能受到损伤，淋巴回流功能障碍。炎症诱导的淋巴管生成是慢性关节炎病程中限制关节炎症的重要补偿机制，改善和维持足够的淋巴引流可能代表慢性炎症性疾病的新治疗策略。

淋巴管影响外渗液体、炎症介质和白细胞的排出，在调节炎症反应中起着至关重要的作用[15]。淋巴管免疫荧光染色显示，TNF-Tg小鼠滑膜中淋巴管新生。独活寄生汤干预后，毛细淋巴管生成增多，集合淋巴管分布更广。结果表明,独活寄生汤可能通过促进淋巴新生，增强淋巴回流功能，加快局部炎症介质和外渗液体回流，进而减轻炎症及水肿情况。相关研究发现，肿瘤坏死因(TNF-α)是影响RA的重要炎症因子，主要由滑膜产生[16]。TNF-α在滑膜处大量积聚，促进周围淋巴管的新生，增强淋巴回流功能，可以加快周围炎症因子的清除，缓解RA的炎症反应。

巨噬细胞对RA的炎症免疫反应及骨量的变化也有影响。影响炎症方面，众所周知M1型巨噬细胞主要分泌促炎因子，加重RA关节炎症反应。M2型巨噬细胞分泌抗炎因子，可以抑制RA的发展进程[17]。影响骨量方面，M1型或M2型单核细胞失衡促进RA患者的破骨细胞生成，滑膜中激活的巨噬细胞和成纤维细胞的相互作用驱动滑膜肥大，最终导致关节软骨和骨的进行性破坏。本实验显示，TNF-Tg小鼠M1型巨噬细胞浸润增加，而DHJST组M1型巨噬细胞减少、炎症改善。这说明独活寄生汤干预可以减少M1型巨噬细胞在TNF-Tg小鼠踝关节处的浸润，减轻炎症免疫反应。有研究报告指出，在RA患者和小鼠关节炎模型中发现滑膜中M1/M2比例增加，促进破骨细胞形成[18]。此外，淋巴管的生成也与巨噬细胞有关，巨噬细胞通过分泌血管内皮生长因子(VEGF-C)为淋巴管新生提供微环境[19]。可见巨噬细胞极化水平对RA的炎症发生和骨量的变化以及淋巴管的新生关系密切。

本研究发现独活寄生汤有促进TNF-Tg小鼠淋巴管的新生及回流功能，减少M1型巨噬细胞数量，减轻炎症反应的效果。因此，独活寄生汤可以应用到相关中西医结合治疗RA的临床和基础研究中。本研究的局限性在于，独活寄生汤抗类风湿作用的机制尚未完全阐明，因此无法确定独活寄生汤影响的靶点,不能对特定的靶点进行针对性的调节。虽然独活寄生汤的调控网络还有待探索，但单核细胞和巨噬细胞被认为是RA的相关治疗靶点，今后可针对这一问题进行深入研究。