Box-Behnken响应面法优化止咳祛痰糖浆中桔梗皂苷D提取工艺*

江凯航，刘东升，朱旭江

（1.甘肃省药品检验研究院，甘肃 兰州730070；2.国家药品监督管理局中药材及饮片质量控制重点实验室，甘肃 兰州730070）

止咳祛痰糖浆具有润肺祛痰、止咳定喘功效，临床用于治疗伤风咳嗽、慢性支气管炎及支气管哮喘。方中，桔梗为君药，有宣肺、利咽、祛痰作用，皂苷类化合物为主要活性成分和特征性成分［1］。研究证实，桔梗皂苷D是桔梗提取物中的主要活性化合物［2］。为了确保产品质量，保证临床用药安全、有效，对制剂中桔梗皂苷D进行定量研究。桔梗皂苷与其他皂苷之间极性相近，测定其含量时，可用正丁醇提取，优选其最佳提取工艺，常采用正交试验或响应面法确定提取工艺的参数。其中，正交试验无法获得设计变量的最优组合和响应目标的最优值，当试验因素具有较多水平数时需进行大量试验，实施较困难。响应面法的试验次数少，试验周期短，精密度高，求得回归方程精度高，预测性能好，能研究几种因素间的交互作用，只要确定合理的影响因素与水平［3］，即能得到较好的优化结果。本研究中以提取次数、洗涤溶剂、洗涤溶剂体积为考察因素，以桔梗皂苷D含量为评价指标，采用Box-Behnken响应面法优化止咳祛痰糖浆中桔梗皂苷D的提取工艺。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20A型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；MS205DU型分析天平（瑞士梅特勒-托利多集团，精度为十万分之一）。

1.2 试药

桔梗皂苷D对照品（中国食品药品检定研究院，批号为111851-201708，含量为97.9%）；止咳祛痰糖浆（康县独一味生物制药有限公司，批号分别为2001056001，2001057001，2001058001，2003057001，2003058001，2003061001，2006056001）；乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 桔梗皂苷D含量测定方法建立

2.1.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：YMC HPLC Column C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测器：蒸发光散射检测器（ELSD）；流动相：乙腈-水（28∶72，V/V）；流速：1.0 mL/min；进样量：5，20 μL（对照品溶液），20 μL（供试品溶液）。理论板数按桔梗皂苷D峰计应不低于3 000。

2.1.2 溶液制备

取桔梗皂苷D对照品适量，精密称定，加甲醇制成质量浓度为0.497 5 mg/mL的桔梗皂苷D对照品溶液。

取样品10 mL，加水20 mL，摇匀，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次30，30，20，20，20 mL，合并正丁醇液；用正丁醇饱和的氨试液洗涤2次，每次30 mL，合并氨试液；再用水饱和的正丁醇振摇提取2次，每次15 mL，合并正丁醇液。回收溶剂至干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得供试品溶液。

按处方比例及制备工艺制备不含桔梗的阴性样品，并按供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.1.3 方法学考察

专属性试验：吸取2.1.2项下3种溶液各适量，按2.1.1项下色谱条件进样测定。结果供试品溶液色谱图中，在与对照品溶液色谱图相同保留时间处有色谱峰出现，阴性对照无干扰。色谱图见图1。

线性关系考察：分别精密吸取2.1.2项下对照品溶液（质量浓度为0.497 5 mg/mL）8，10，15，25，30，40 μL，以进样量（X，μg）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=362 965X-838 129，R2=0.999 0，（n=6）。结果表明，对照品溶液进样量在3.980 2～19.901 1 μg范围内与峰面积线性关系良好。

定量限与检测限确定：取线性关系考察项下对照品溶液（质量浓度为3.980 0 mg/mL）适量，用甲醇逐级稀释，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。当信噪比（S/N）为3∶1时，计算得待测成分的检测限为0.199 0 mg/mL；当S/N为10∶1时，计算得待测成分的定量限为0.796 0 mg/mL。

精密度试验：取2.1.2项下对照品溶液（质量浓度为0.497 5 mg/mL）20 μL，按2.1.1项下色谱条件连续进样测定6次。结果峰面积的RSD为2.40%（n=6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为2003061001）适量，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，取20 μL，分别于0，4，6，8，12，24 h时按2.1.1项下色谱条件进样测定。结果峰面积的RSD为1.65%（n=6），表明供试品溶液24 h内稳定性良好。

重复性试验：取样品（批号为2003061001）适量，共6份，依法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算含量。结果含量的RSD为1.46%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（批号为2003061001）5 mL，共6份，分别加入对照品溶液（质量浓度为0.497 5 mg/mL）各1 mL，依法制备供试品溶液，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并按外标法计算含量。结果见表1。

2.2 桔梗皂苷D提取方法优化

2.2.1 单因素试验

提取次数：取样品（批号为2003061001）10 mL，共6份，加水20 mL，摇匀，用水饱和的正丁醇分别振摇提取4次（每次30，30，20，20 mL），5次（每次30，30，20，20，20 mL），6次（每次30，30，20，20，20，20 mL），各2份，合并正丁醇液，用氨试液洗涤2次，每次30 mL，合并正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至5 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并按外标法计算桔梗皂苷D含量。结果用水饱和的正丁醇提取4次、5次、6次的提取液中桔梗皂苷D的平均含量分别为0.90，0.91，0.90 mg（n=3），故选择水饱和的正丁醇提取5次，每次30，30，20，20，20 mL。

洗涤溶剂：取样品（批号为2003061001）10 mL，共6份，加水20 mL，摇匀，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次30，30，20，20，20 mL，合并正丁醇液，分别用氨试液、正丁醇饱和的氨试液、正丁醇饱和的水洗涤2次，每次30 mL，各2份，正丁醇液回收溶剂至干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至5 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并按外标法计算桔梗皂苷D含量。结果上述各洗涤溶剂中桔梗皂苷D的含量分别为0.91，1.12，0.92 mg（n=3），故选择正丁醇饱和的氨试液洗涤2次，每次30 mL。

洗涤溶剂体积：取样品（批号为2003061001）10 mL，共6份，加水20 mL，摇匀，用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次30，30，20，20，20 mL，合并正丁醇液，用正丁醇饱和的氨试液洗涤2次，每次30 mL，用水饱和的正丁醇分别振摇提取0次、1次、2次，每次15 mL，各2份，合并氨试液或正丁醇液，回收溶剂至干，残渣加甲醇适量使溶解，定量转移至5 mL容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按2.1.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并按外标法计算桔梗皂苷D含量。结果上述各洗涤溶剂中桔梗皂苷D的含量分别为1.23，1.25，1.26 mg（n=3），故选择用水饱和的正丁醇洗涤2次，每次15 mL。

2.2.2 Box-Behnken响应面试验

试验设计与结果：在单因素试验基础上，采用Box-Behnken模型设计试验，以提取次数（因素A）、洗涤溶剂（因素B）、洗涤溶剂体积（因素C）为自变量，以10 mL洗涤溶剂中桔梗皂苷D含量为响应值（Y）进行响应面分析，确定最佳提取工艺条件。因素与水平见表2，试验设计与结果见表3。

表2 因素与水平Tab.2 Factors and their levels

表3 Box-Behnken响应面试验设计与结果Tab.3 Design and results of the BBD-RSM

结果分析：采用Design-Expert.V8.0.6软件进行回归分析，并进行二项式拟合和多元线性回归分析，得二次多项回归方程Y=1.25+0.019A-0.010B+0.056C+0.020AB-7.500E-003AC-0.015BC-0.038A2-0.250B2-0.028C2。为验证方程的有效性，对桔梗皂苷D提取的数学模型进行方差分析，P＜0.05为影响显著，P＜0.01为影响极显著，方差分析结果见表4。可见，模型P＜0.000 1，表明该回归模型达到了极显著水平；失拟项P=0.751 0＞0.05，表明该失拟项不显著；二项式拟合相关系数R2=0.999 7，表明本次试验选择二项式拟合模型为成功模型；模型的修正相关系数R2Adj=0.999 2，表明预测值和实测值基本吻合，预测性良好［4］，该拟合方程能准确反映提取次数、洗涤溶剂、洗涤溶剂体积对桔梗皂苷D含量的影响，一次项、交互项和二次项均达到极显著水平，故该模型可用于分析与预测止咳祛痰糖浆中桔梗皂苷D的提取工艺。

表4 方差分析结果Tab.4 Results of ANOVA

响应面分析：采用Design-Expert.V8.0.6软件对试验结果进行分析，得到桔梗皂苷D含量与各因素交互作用的三维响应面图（图2）。可见，桔梗皂苷D含量与提取次数、洗涤溶剂、洗涤溶剂体积间的交互作用明显，与方差分析结果一致。

2.2.3 试验结果验证

利用Design Expert软件结合Box-Behnken响应面试验，制备了数学模型，得到最优提取工艺参数，即用水饱和的正丁醇振摇提取5次，每次30，30，20，20，20 mL；用正丁醇饱和的氨试液洗涤2次，每次15 mL。按此优选工艺制备3批样品，测得每10 mL样品中桔梗皂苷D的平均含量为1.264 8 mg，与理论值接近，表明该模型可靠。

3 讨论

3.1 检测器选择

在对桔梗皂苷的研究中发现，高效液相色谱-蒸发光散射检测器（HPLC-ELSD）法［5］和反相高效液相色谱（RP-HPLC）法［6］等应用较广。桔梗皂苷D无共轭结构，无强的发色基团，末端吸收检测干扰较大［6］，故紫外检测器并非桔梗皂苷D的最佳检测仪器。参考文献［7-9］，最终采用HPLC-ELSD法。

3.2 供试品溶液制备方法考察

参考2020年版《中国药典（一部）》桔梗（50%甲醇提取后过硅胶柱）、桔梗冬花片和甘桔冰梅片（50%甲醇提取后正丁醇萃取）中桔梗皂苷D的含量测定方法，当归补血口服液（直接用正丁醇萃取）、芪冬颐心口服液（直接用正丁醇萃取）中皂苷类成分黄芪甲苷的含量测定方法，以及文献［10-11］中报道的桔梗皂苷D的含量测定方法，并结合桔梗药材和制剂制法项下桔梗药材的入药方式，最终确定为本供试品溶液制备方法。

A.洗涤溶剂-提取次数B.洗涤溶剂-洗涤溶剂体积C.提取次数-洗涤溶剂体积图2各因素交互作用对桔梗皂苷D含量影响的响应面三维图A.Washing solvent-extraction times B.Washing solvent-washing solvent volume C.Extraction times-washing solvent volumeFig.2 Three-dimensional diagrams of response surface of the effects of the two-factor interaction on the content of platycodin D

3.3 方法评价

本研究中建立了桔梗皂苷D含量测定的HPLCELSD法，并通过单因素试验和Box-Behnken响应面法优选了止咳祛痰糖浆中桔梗皂苷D的最佳提取方法，结果直观、可靠，能将止咳祛痰糖浆中桔梗皂苷D基本提取完全。