Box-Behnken响应面法优选土茯苓七味汤提取工艺*

耿宏侠，王宇佳，于英杰，吴亚男，张新悦，严德康，郭睿博，李学涛，程 岚

（辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连116600）

土茯苓七味汤是蒙医传统药方，出自蒙医经典著作《珊瑚验方》［1］，别名陶匹浪-7，由土茯苓、金银花、诃子、川楝子、栀子、黄连、瞿麦7味中药材共研成细末制成汤剂［2］，主治血热引起的头痛、咽喉肿痛、面部疱疹、经血淋漓等诸血症。方中，君药土茯苓清热，性平，味甘淡，归肝、胃经，有除湿、解毒、通利关节功效；金银花、黄连、瞿麦和栀子清血热，为臣药；配以诃子和中，调理体质，川楝子祛巴达干、希拉，为佐使药。诸药合用，效力更佳［3-4］。湿疹为常见炎性皮肤病，临床采用抗菌药物、激素、抗组胺药等治疗，对于疼痛、瘙痒有缓解作用，但易复发，长期应用易引发多种药品不良反应，且易产生依赖性。中医药治疗湿疹副作用小，复发率低，效果佳，可选择中药汤剂、中成药、外用中成药、中药提取物，以及中药塌渍疗法、中药药浴疗法、中药熏蒸疗法等中医特色疗法［5-6］。土茯苓七味汤为蒙医经典方，临床应用广泛，治疗血热引起的面部疱疹和皮肤湿疹的疗效显著。目前，中药复方提取工艺的优化方法有正交试验［7］、Box-Behnken响应面法［8］等。本研究中选择落新妇苷含量、干膏得率作为主要考察指标，并结合Box-Behnken响应面法优化土茯苓七味汤的提取工艺，为其后续研究提供试验数据。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

FA1004型电子天平（上海越平科学仪器有限公司，精度为0.1 mg）；B220型电热恒温水浴锅、DZF型真空干燥箱（北京市永光明医疗仪器有限公司）；20AT型液相色谱仪（日本岛津公司），配有紫外检测器。

1.2 试药

落新妇苷对照品（大连美仑生物技术有限公司，批号为29838-67-3，纯度大于98%）；冰醋酸、甲醇、乙醇均为分析纯，水为纯净水；土茯苓（产地广西，批号为210301），诃子（产地广东，批号为210115），栀子（产地河南，批号为210101），川楝子（产地安徽，批号为210103），黄连（产地四川，批号为210313），瞿麦（产地河北，批号为201101），均购自安徽道源堂中药饮片有限公司；金银花（亳州市康易饮生物科技有限公司，产地安徽，批号为210310）。上述中药材均经辽宁中医药大学药学院许亮教授鉴定为正品，符合2020年版《中国药典（一部）》相关项下要求。

2 方法与结果

2.1 干膏得率测定

按处方比例精密称取土茯苓、金银花、诃子、栀子、川楝子、黄连、瞿麦7味药材共41 g，置圆底烧瓶中，加入适量乙醇，回流提取3次，滤过，合并滤液，浓缩滤液，置坩埚中，65℃减压干燥至恒重，计算干膏得率。

2.2 落新妇苷含量测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-0.1%冰醋酸溶液（36∶64，V/V）；流速：1 mL/min；柱温：30℃；检测波长：291 nm［9］。

2.2.2 溶液制备

取落新妇苷对照品0.2 mg，精密称定，加60%甲醇1 mL，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得对照品溶液。按处方比例精密称取土茯苓、金银花、诃子、栀子、川楝子、黄连、瞿麦7味药材共41 g，置圆底烧瓶中，加入适量乙醇，回流提取3次，滤过，合并滤液，0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。按处方比例精密称取缺土茯苓的其余6味药材，同供试品溶液制备方法制备阴性对照品溶液。

2.2.3 方法学考察

专属性试验：分别吸取2.2.2项下3种溶液各适量，按2.2.1项下色谱条件进样测定。结果分离度良好，且阴性对照无干扰。色谱图见图1。

线性关系考察：取落新妇苷对照品适量，精密称定，加60%甲醇制成质量浓度分别为0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，3.0 mg/mL的系列对照品溶液，按2.2.1项下色谱条件进样测定，以落新妇苷质量浓度（X，mg/mL）为横坐标、峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归，得回归方程Y=1 E+07X+98 409，R2=0.999 1（n=6）。结果表明，落新妇苷质量浓度在0.1～3.0 mg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

定量限和检测限确定：取对照品溶液，用甲醇逐级稀释，按2.2.1项下色谱条件进样测定，分别以信噪比（S/N）为3∶1和10∶1的质量浓度计算检测限和定量限。结果落新妇苷的检测限为0.23 μg/mL，定量限为0.76 μg/mL。

精密度试验：精密吸取对照品溶液10 μL，按2.2.1项下色谱条件在同1 d内连续进样测定6次，计算日内精密度；连续测定3 d，每天2次，计算日间精密度。结果日内精密度和日间精密度的RSD分别为0.97%和1.68%（n=6），表明仪器精密度良好。

重复性试验：取样品，精密称定，按Box-Behnken试验3号方案平行制备供试品溶液6份，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为1.28%（n=6），表明方法重复性良好。

稳定性试验：取样品，精密称定，按Box-Behnken试验3号方案制备供试品溶液，于室温放置0，4，8，12，16，24 h，按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果的RSD为1.20%（n=6），表明供试品溶液在室温下放置24 h内稳定性良好。

加样回收试验：取样品，精密称定，按Box-Behnken试验3号方案平行制备供试品溶液6份，按1∶1的比例加入对照品溶液（质量浓度为2 mg/mL），按2.2.1项下色谱条件进样测定，记录峰面积，并计算加样回收率。结果落新妇苷的平均加样回收率为99.33%，RSD为1.89%（n=6），表明方法准确度良好。

2.3 提取工艺优选

2.3.1 试验设计

应用三因素三水平的Box-Behnken响应面法评估和优化过程变量的影响，以乙醇体积分数（因素A）、乙醇用量（因素B）、提取时间（因素C）作为影响因素。考虑提取次数为非连续变量，难以进行回归处理，结合相关文献初步设定为3次，各因素设3个水平，分别用-1，0，1表示［10］，因素与水平见表1。以落新妇苷含量和干膏得率的总评归一值（OD）为评价指标，落新妇苷含量为主要指标，权重系数设为0.8；干膏得率为次要指标，权重系数设为0.2。试验设计与结果见表2，计算公式如下［11-13］。

表1 因素与水平Tab.1 Factors and their levels

表2 Box-Behnken试验设计与结果Tab.2 Design and results of the BBD

A.供试品溶液B.对照品溶液C.阴性对照品溶液图1高效液相色谱图1.AstilbinA.Test solution B.Reference solution C.Negative reference solutionFig.1 HPLC chromatograms

式（1）中，Ymax为指标最大值，Ymin为指标最小值，Yi为指标i测定值，di为落妇新苷含量归一值；式（2）中，d1为落新妇苷含量归一值，d2为干膏得率归一值。

2.3.2 模型拟合与方差分析

使用Design-Expert V8.0.6统计软件，以OD为因变量对各因素进行二次多项式拟合，得拟合方程Y=0.92+0.081A+0.023B+0.17C-0.014AB+0.075AC+9.500E-003BC-0.49A2-0.15B2-0.23C2（r=0.994 2，P＜0.05）。P＜0.05为对结果有显著影响，P＜0.01为对结果有极显著影响［14］。方差分析结果见表3。可见，回归模型P＜0.000 1，表明回归模型显著；各因素影响程度由大至小依次为因素C＞因素A＞因素B，即提取时间＞乙醇体积分数＞乙醇用量，其中A，C，A2，B2，C2对结果有极显著影响（P＜0.01），AC对结果有显著影响（P＜0.05），B，AB，BC对结果的影响不显著（P＞0.05）。

表3 方差分析结果Tab.3 Results of the ANOVA

2.3.3 工艺条件优化与预测

各因素对OD影响的三维响应面图和二维等高线图见图2。可见，因素B对OD的影响较小，因素A和因素C对OD的影响显著；上述交互因素中，因素A与因素C的响应面形状较陡峭，等高线呈椭圆形，表明因素A与因素C的交互作用更明显。利用Design-Expert V8.0.6统计软件预测出的最优提取工艺为加8.16倍量62.2%乙醇，提取3次，每次101.52 min，OD的预测值为0.955 3。

2.4 验证试验

通过Box-Behnken响应面法得到了最优提取工艺，为方便试验操作，将提取条件调整为加8倍量60%乙醇，提取3次，每次90 min，进行3次验证试验。结果OD的预测值为0.955 3，实测值分别为0.952 1，0.924 5，0.938 7，平均为0.938 4，与预测值的相对偏差为1.76%（＜5%），表明所建立的模型预测性良好。

3 讨论

参照2020年版《中国药典（一部）》土茯苓含量测定项下色谱条件，以甲醇-0.1%冰醋酸溶液（39∶61，V/V）为流动相［9］，考察色谱分离情况，结果落新妇苷色谱峰与其他杂质色谱峰分离效果不理想；后以甲醇-0.1%冰醋酸溶液（36∶64，V/V）为流动相，结果落新妇苷色谱峰分离度良好，保留时间适宜，理论板数较高，在本试验确定的色谱条件下，理论板数按落新妇苷峰计不低于5 000。故确定流动相为甲醇-0.1 %冰醋酸溶液（36∶64，V/V）。本研究中采用高效液相色谱法测定土茯苓七味汤中落新妇苷的含量，方法学考察结果均良好。该方法简便快捷、灵敏度高、准确可靠、适用性强，可用于落新妇苷的含量测定。

A.乙醇体积分数-乙醇用量B.乙醇体积分数-提取时间C.乙醇用量-提取时间图2两因素交互作用对总评归一值影响的响应面三维图和等高线图A.Volume fraction of ethanol-amount of ethanol B.Volume fraction of ethanol-extraction time C.Amount of ethanol-extraction timeFig.2 Three-dimensional diagrams and contour diagrams of response surface of the effects of the two-factor interaction on the OD

Box-Behnken响应面法可连续分析试验的各个水平，找到整个区域中因素的最佳组合和响应的最优值。相较于正交设计法和均匀设计法，试验次数少，试验精度高，所得结果更合理可靠、清晰直观，但其局限性为最优条件要在设计的因素水平范围内［15］。本研究中确定了土茯苓七味汤的最优提取工艺为加8倍量60%乙醇，提取3次，每次90 min。与文献［16-17］优选工艺相比，所得落新妇苷提取率较高，且实测值与预测值相符，表明Box-Behnken响应面法优选得到的提取工艺可靠，具有一定的实际应用价值，可为土茯苓七味汤的后续研究提供参考。