八仙花对铅锌的抗性及富集特征1)

张瑛 宋子怡 赵冰

(西北农林科技大学，陕西·杨凌，712100)

重金属污染是全球的生态危机，给植物生长和人类健康带来了很大影响[1]；对于城市或一些人类密切接触区域的重金属污染，利用观赏植物进行植物稳定是合理的策略。植物稳定过程，不仅抑制了金属污染物的进一步渗透和移动，防止了地下水污染[2]；而且转移到植物地上部的金属尽可能少，避免了人群与重金属的接触[3]。此外，观赏植物，具有较高的观赏性和居民适应性，更适用于城市地区的植物修复[4]；但目前将观赏植物用于植物修复的研究较少。

八仙花(Hydrangeamacrophylla)是一种常见的木本花卉。它不仅具有很高的观赏价值，而且还具有生长速度快、生物量大、根系发达的优点。八仙花还对金属具有一定的抵抗力，是研究植物修复的良好材料[5-6]。但是，关于对八仙花、重金属的研究，主要集中在单一重金属污染方面[7-8]，涉及复合污染的研究较少。锌(Zn)、铅(Pb)是重金属污染中最相关的两种，在植物体内存在竞争[9]、协同[10]两种作用，这两种不同的相互作用直接影响植物对金属离子的累积和不同层次上的生物毒性[11]。

为此，本研究以选自温室中生长健壮的1年生八仙花扦插苗、采集自实验基地附近农田表层土壤(0～15 cm)为基材，以不同质量分数的硝酸铅溶液(Pb(NO3)2)、七水硫酸锌溶液(ZnSO4·7H2O)为铅锌胁迫处理剂；按照试验设计方案，将铅锌胁迫处理剂(单一、协同)均匀喷洒入处理好的基材土壤，然后置于阴凉处30 d，使土壤中的重金属稳定(污染土壤)。将污染土壤加入花盆中，每盆种植1株1年生八仙花；生长试验持续50 d后，测定生长指标、生理指标、光合指标、重金属质量分数及亚细胞分布。应用方差分析法、最小显著差异法，分析八仙花对铅、锌的单一胁迫和协同胁迫的防御机制和富集特征。旨在为八仙花用于城市铅锌污染土壤的环境美化和生态治理提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验在西北农林科技大学科研温室(北纬34°15′，东经108°30′)进行，生长试验从2020年11月7日—2020年12月27日，共50 d。八仙花(Hydrangeamacrophylla)选自温室中生长健壮的1年生扦插苗，土壤采集自实验基地附近农田的表层土壤(0～15 cm)。土壤性质pH为7.44、有效氮质量分数为112 mg/kg、有效磷质量分数为7.80 mg/kg、有效钾质量分数为219 mg/kg。将土壤在干燥通风处风干、粉碎，并用孔径4 mm筛过筛。按照试验设计，将不同质量分数的硝酸铅(Pb(NO3)2)、七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O)溶液(单一、协同)均匀喷洒入处理好的土壤，然后置于阴凉处30 d，使土壤中的重金属稳定(污染土壤)。

1.2 试验设计

将污染土壤加入提前清洗好的花盆中，每盆含有6.0 kg土壤，种植1株八仙花，每个处理3个重复，持续生长50 d后进行收获八仙花植株。试验期间，土壤湿度保持在田间持水量的70%，温室的平均温度保持在20～25 ℃，用自然光照射，光照时间为10 h。

参考GB15618—1995《土壤环境质量标准》、GB15618—2018《土壤环境质量农用地土壤污染风险管控标准(试行)》，试验用铅锌胁迫处理液质量分数，按照高、中、低梯度(单一胁迫处理、协同胁迫处理)设计：①对照(不施用铅锌胁迫处理液)；②低质量分数铅胁迫处理(质量分数为500 mg/kg的Pb(NO3)2溶液)；③中质量分数铅胁迫处理(质量分数为1000 mg/kg的Pb(NO3)2溶液)；④高质量分数铅胁迫处理(质量分数为2 000 mg/kg的Pb(NO3)2溶液)；⑤低质量分数锌胁迫处理(质量分数为300 mg/kg的ZnSO4·7H2O溶液)；⑥中质量分数锌胁迫处理(质量分数为600 mg/kg的ZnSO4·7H2O溶液)；⑦高质量分数锌胁迫处理(质量分数为1 200 mg/kg的ZnSO4·7H 2O溶液)；⑧低质量分数铅锌协同胁迫处理(“质量分数为500 mg/kg的Pb(NO3)2溶液+质量分数为300 mg/kg的ZnSO4·7H2O溶液”)；⑨中质量分数铅锌协同胁迫处理(“质量分数为1 000 mg/kg的Pb(NO3)2溶液+质量分数为600 mg/kg的ZnSO4·7H2O溶液”)；⑩高质量分数铅锌协同胁迫处理(“质量分数为2 000 mg/kg的Pb(NO3)2溶液+质量分数为1 200 mg/kg的ZnSO4·7H2O溶液”)。

1.3 各评价指标测定方法

生长指标测定：生长试验持续50 d结束后，收获八仙花植株，测量每株八仙花的株高、根长。用蒸馏水冲洗后，把植株分成根、茎、叶3部分，放入烘箱中105 ℃干燥20 min，然后再70 ℃干燥至恒质量，测定各部分干质量。

生理指标测定：取八仙花的新鲜，洁净叶片进行生理指标的测定。光合色素，借鉴李合生[12]的方法测定；丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)，分别采用硫代巴比妥酸法[13]、茚三酮比色法测定；超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)，分别使用氮蓝四唑法、愈创木酚法、紫外吸收法测定。

光合指标测定：八仙花叶片光合参数的测定使用Li-6400光合仪在09:00—11:00进行，测定时设定CO2摩尔分数为400 μmol·mol-1、光合有效辐射为1 000 μmol·m-2·s-1、叶室温度为25 ℃。每组取完整成熟叶片进行测量，每个处理重复3次。记录每次测量叶片的净光合速率(Pn)，气孔导度(Gs)，胞间CO2摩尔分数(Ci)、蒸腾速率(Tr)。

重金属质量分数及亚细胞分布测定：分别称量植株样本0.2 g，土壤样本0.1 g粉碎过筛后，使用微波消解仪(MA165-001，意大利)进行消解。使用火焰原子吸收光谱仪(PinAAciie，美国PE900)测定金属质量分数。并计算各种处理时，八仙花对铅和锌的生物富集系数(BCF)和转移因子(TF)；生物富集系数=植株重金属质量分数/土壤中重金属质量分数，转运系数=植株地上部分重金属质量分数/植株根部重金属质量分数。

植株的亚细胞，借鉴文献[14]的方法进行分离，将分离得到的细胞壁部分、细胞膜和细胞器部分、细胞可溶性部分在烘箱中70 ℃进行干燥。干燥完成后，用微波消解仪消解，用火焰原子吸收光谱仪测定重金属质量分数。

使用SPSS 26.0分析软件进行统计分析(ANOVA)，使用最小显著差异法进行多重比较(P<0.05)。

2 结果与分析

2.1 铅锌胁迫处理对八仙花植株生物量的影响

由表1可见：低质量分数的铅和锌都会促进八仙花株高的发育；与铅相比，低质量分数锌的促进作用更明显；铅锌协同胁迫处理时，锌的促进作用受到减弱。八仙花的根长，在低质量分数的铅锌协同胁迫处理时，对八仙花的根长有促进作用；在中、高质量分数铅锌协同胁迫处理时，均对八仙花的根长有显著抑制作用(P<0.05)，与对照相比，八仙花的根长分别减少了21.9%、36.7%。在铅胁迫处理时，八仙花根系不仅伸长受到抑制，还发生了明显的变黑，甚至腐烂现象(见图1)，严重影响八仙花植株生长。植物的生物量，在一定程度上可以反应植株对土壤重金属的耐受能力[15]。本研究中，八仙花在低、中质量分数铅锌的单一胁迫处理时，根、茎、叶的干质量几乎不变或增加，没有受到抑制；而高质量分数铅锌的单一胁迫处理时，八仙花所有部位的干质量基本都减少。单一金属胁迫处理与协同胁迫处理相比，低质量分数金属单一胁迫处理对八仙花干质量的促进作用更明显；高质量分数金属单一胁迫处理对八仙花干质量的抑制作用更明显。

表1 不同胁迫处理时八仙花植株的生长形态及生物量

CK为对照(不施用铅锌胁迫处理液)；LPb、MPb、HPb，分别为低、中、高质量分数铅胁迫处理；LZn、MZn、HZn，分别为低、中、高质量分数锌胁迫处理；“LPb+LZn”、“MPb+MZn”、“HPb+HLZn”，分别为低、中、高质量分数铅锌协同胁迫处理。图1 不同胁迫处理时八仙花植株的根系形态

2.2 铅锌胁迫处理对八仙花植株生理指标的影响

由表2可见：在所有的重金属胁迫处理时，八仙花植株的丙二醛质量摩尔浓度都显著增加(P<0.05)，其中在高质量分数铅胁迫处理时，丙二醛质量摩尔浓度最高，是对照的19.7倍。丙二醛质量摩尔浓度均随重金属质量分数的增加呈上升趋势，其中铅锌协同胁迫处理的作用弱于单一金属胁迫处理，单一铅胁迫处理的效果最强。脯氨酸的变化基本与丙二醛一致，脯氨酸的最高质量分数也出现在高质量分数铅胁迫处理时，是对照的1.9倍。在所有重金属胁迫处理时，超氧化物歧化酶活性均增强，随着铅质量分数的增加，超氧化物歧化酶活性变化并不显著(P<0.05)。总体看，金属质量分数和种类的变化，对八仙花超氧化物歧化酶活性的影响不大。过氧化氢酶活性随铅质量分数的升高而增加，在高质量分数铅胁迫处理时活性最高，与对照相比增加了157.7%(见表2)。随着锌质量分数的增加，过氧化氢酶活性呈现先增加后减少的趋势；在铅锌协同胁迫处理时，随着两种金属质量分数的增加，过氧化氢酶活性变化不明显。过氧化物酶活性随重金属质量分数的增加而增加，单一高质量分数锌胁迫处理的作用最明显。3种酶中，过氧化物酶酶的活性远远高于其他两种。铅和锌会影响八仙花植株的色素质量分数，在所有铅胁迫处理时，叶绿素a质量分数都显著高于对照(P<0.05)；在单一锌胁迫处理时，叶绿素b质量分数变化不大，其他胁迫处理均促进八仙花叶绿素b的合成；类胡萝卜素质量分数的变化比较复杂，随着铅质量分数的增加呈先上升后下降的趋势，随着单一锌质量分数增加的胁迫处理、铅锌协同质量分数增加的胁迫处理呈先下降后增加的趋势。

表2 不同铅锌胁迫处理时八仙花的生理指标

2.3 铅锌胁迫处理对八仙花光合特性的影响

由表3可见：重金属胁迫处理，对八仙花光合指标均具有影响。净光合速率最大值(8.77 μmol·m-2·g-1)出现在中等质量分数铅胁迫处理时，与对照相比增加了14.2%；净光合速率最小值(6.39 μmol·m-2·g-1)出现在高质量分数锌胁迫处理时，与对照相比降低了16.8%；说明锌对八仙花的光合作用的破坏程度更大。蒸腾速率，随单一锌质量分数增加的胁迫处理、铅锌协同质量分数增加的胁迫处理逐渐减小，随着铅质量分数的增加先减小后增大；与对照相比，在低、中质量分数锌的胁迫处理时，对八仙花的蒸腾速率有促进作用。胞间CO2摩尔分数的变化与蒸腾速率一致，几乎在所有添加金属的胁迫处理时都受到抑制。气孔导度的变化相对复杂，随铅质量分数增加的胁迫处理，气孔导度先下降后增加；随锌质量分数增加的胁迫处理，气孔导度先增加后下降；随铅锌协同质量分数增加的胁迫处理，气孔导度逐渐减小。

表3 不同铅锌胁迫处理时八仙花的光合特性

2.4 铅锌胁迫处理对八仙花重金属富集特性的影响

由表4可见：随着单一铅、锌质量分数增大的胁迫处理，八仙花各部位的重金属质量分数均随之增大。八仙花体内，铅质量分数由大到小依次为根、叶、茎，锌质量分数由大到小依次为根、茎、叶。尽管土壤中的铅质量分数远高于锌质量分数，但是八仙花吸收的锌却多于铅，即锌比铅更容易被八仙花吸收，能在八仙花体内大量积累。在铅锌协同胁迫处理时，与对照相比，八仙花吸收两种金属的总量都增加，叶片中两种金属的质量分数都减小。重金属的种类与重金属质量分数，对八仙花的富集系数(BCF)、转运系数(TF)有影响(见表5)。八仙花对铅的富集系数，随铅质量分数的增加而逐渐减小，但变化不明显；八仙花对锌的富集系数，随锌质量分数的增大而增大。在铅锌协同胁迫处理时，八仙花对铅的富集和转运能力均增大，但变化不显著；八仙花对锌的富集能力，在低、中质量分数铅锌协同胁迫处理时增大，在高质量分数铅锌协同胁迫处理时减小；铅锌协同胁迫处理对锌的转运系数减小。

表4 不同铅锌胁迫处理时八仙花积累的重金属质量分数

表5 不同铅锌胁迫处理时八仙花对重金属富集系数和转运系数

2.5 铅锌胁迫处理对八仙花重金属亚细胞分布的影响

由表6可见：八仙花不同部位对重金属的积累方式不同。在单一金属的胁迫处理时——八仙花根部的铅主要积累在细胞壁部分(39.45%)，茎部的铅主要积累在细胞器部分(40.20%)，叶片的铅主要积累在细胞可溶性部分(53.47%)；与铅的积累不同，八仙花根部、叶片都将锌主要积累在细胞器部分(53.11%～44.97%)，茎部主要积累在细胞可溶性部分(70.82%)。在铅锌协同胁迫处理时，八仙花根部细胞器积累的铅、锌均减小，八仙花各个部位细胞壁积累的铅均减少，细胞可溶性部分积累的铅增加。

表6 不同铅锌胁迫处理时八仙花的重金属亚细胞分布

亚细胞部位锌的亚细胞分布比例/%根MPbMPb+MZn茎MPbMPb+MZn叶MPbMPb+MZn细胞可溶性部分(11.43±0.01)c(39.90±1.61)a(70.82±0.23)a(56.15±1.05)a(30.06±0.52)b(44.78±0.71)a细胞器部分(53.11±0.53)a(35.77±1.76)a(21.20±0.44)b(28.47±1.00)b(44.97±0.43)a(43.17±1.03)a细胞壁部分(35.46±0.53)b(24.32±0.19)b(7.97±0.38)c(15.39±0.12)c(24.97±0.21)c(12.06±0.41)b

3 讨论

植物的生长状况是植物耐受重金属胁迫的直观表现[16]，通过观测植物的生长性状评估植物对环境中刺激源的反应是一种清晰简便的方式。本研究中，铅和锌在高质量分数时，对八仙花造成了一系列伤害，而在低、中质量分数时，对八仙花的株高和生物量有促进作用，表现出明显的“低促高抑”现象。这种低质量分数胁迫处理时的促进作用，可以用兴奋现象解释[9]，即植物在逆境条件时，会最大程度地提高生命活动，抵制不良环境，表现出生长旺盛的现象[17]。与株高、生物量的反应不同，所有胁迫处理都对根系生长产生了抑制，说明根系比其他部位受到重金属的毒害更大。这是因为根系是最先接触金属的器官，不仅受到重金属的毒害最早，而且持续时间最长。在重金属胁迫时，八仙花根系表现出的表型可塑性，不仅是八仙花受到重金属胁迫的结果，也是八仙花耐受污染土壤的一种机制。而在铅锌协同胁迫处理时，八仙花生长受到的促进和抑制，都没有在单一金属胁迫处理时明显。这说明，铅锌协同胁迫处理，不仅会减弱单一重金属胁迫处理的负面效应，而且减弱了单一重金属胁迫处理对八仙花生长的影响。

生理指标的变化，能更清晰地体现不良环境对植物的影响。丙二醛是膜脂过氧化的产物，能反映植物体内总抗氧化能力的强弱。在本研究中，重金属的添加引起八仙花植株内丙二醛质量摩尔浓度的显著上升。这个变化，一方面说明重金属对八仙花造成了严重的膜脂过氧化损伤，一方面也说明八仙花抗氧化系统对重金属胁迫有较强的抗性。脯氨酸对调节细胞的渗透功能具有重要作用。加入重金属后，脯氨酸质量分数上升，说明植物通过自身调节机制，产生大量脯氨酸抵抗重金属造成的细胞损伤和缓解重金属引起的水分缺乏[18]。本研究中，丙二醛质量摩尔浓度、脯氨酸质量分数随着重金属质量分数的增加而增加，说明八仙花对这两种金属的单一、协同胁迫具有一定抗性，八仙花可以通过自身调节抵抗此质量分数的重金属胁迫。

重金属不仅会影响植物的细胞结构，还会破坏细胞的正常氧化还原平衡，引起氧化应激的发生[19]，这是重金属对植物的主要毒性作用。在本研究中，3种氧化还原酶活性都随着重金属的添加而增强，说明八仙花可以通过对抗氧化酶的过度表达，清除有害的O2-，维持植物的正常生长。其中过氧化氢酶活性在高锌胁迫处理时活性降低，说明高锌胁迫处理对八仙花的毒害超过了植物的自我调节能力，打破了酶活性与活性氧(ROS)之间的平衡。综合3种氧化还原酶在重金属胁迫处理时活性的变化，表明在锌质量分数小于铅质量分数时，锌对八仙花抗氧化系统的毒害作用却更大。

在植物抗氧化系统中，类胡萝卜素对活性氧的清除非常有效。除了在光合反应中心的结构功能外，类胡萝卜素还通过清除活性氧，在保护光合系统免受氧化损伤方面发挥着重要作用[20]。本研究中，八仙花的类胡萝卜素质量分数变化，也说明了八仙花可以通过调节自身色素质量分数保护光合系统，抵抗重金属的毒害。在铅胁迫处理时八仙花叶绿素质量分数增加，锌胁迫处理时叶绿素质量分数减少；说明八仙花的光合系统对锌更为敏感，更容易受到锌的破坏。这是因为Zn2+可以取代叶绿素分子中的Mg2+，造成叶绿素的大量失活[21]；Zn还可以抑制气孔保卫细胞的水通道，从而对八仙花的光合作用产生气孔限制[22]。在恶劣环境时，植株光合能力的下降有两个因素：一是非气孔因素，二是气孔因素。在本研究中，八仙花植株净光合速率下降时，气孔导度、胞间CO2摩尔分数都呈下降趋势，说明八仙花光合速率下降主要是由气孔因素导致的。

植物对金属的富集和转运能力，与金属种类和浓度有关。Basta et al.[23]研究表明，金属对土壤的亲和力，由大到小依次为Pb的亲和力、Cu的亲和力、Ni的亲和力大于等于Cd的亲和力和Zn的亲和力，且锌在土壤中的解吸过程是自发的[24]。因此与铅相比，锌在土壤中的流动性更高，更容易被植物吸收。本研究中，八仙花对铅、锌的富集系数都小于1，说明八仙花对这两种金属都具有一定避性，这是八仙花对重金属毒害的一种防御机制。八仙花将铅、锌大量聚集在根部，导致这两种金属向地上部的转移减少，从而避免重金属对叶片中存在的光合机构的破坏，也是八仙花对重金属的一种耐性机制，也表明八仙花对这两种金属具有植物稳定的潜力[25]。在本研究中铅锌协同胁迫处理时，八仙花吸收的铅、锌的总量增加，说明铅、锌在八仙花体内产生了协同作用。这是因为高质量分数的两种金属对植物细胞造成了严重损伤，金属更容易进入细胞，或是在多次暴露在重金属条件下，植物根系释放的分泌物，会增加金属的移动性，然后促进其在根系中的吸收[26]。本研究表明，较低质量分数的铅可以促进八仙花吸收锌，高质量分数的铅则抑制八仙花吸收锌。原因是大量的金属积累在根、茎部，破坏了八仙花根系的吸收和运输能力，八仙花吸收锌的能力下降。

植物可以将重金属固定在生物活性低的区域，以减少重金属对植物正常生命活动的影响。在本研究中，铅大部分聚集在八仙花的细胞壁部分，是因为细胞壁含有大量的果胶、多糖、蛋白质，可以与金属离子形成稳定的络合物[27]，避免金属进入细胞，破坏原生质。锌主要聚集在细胞的可溶性部分，说明大部分锌可以穿过细胞壁，进入细胞原生质。锌主要在液泡中被分离，大部分由液泡组成的细胞可溶性部分富含硫肽和有机酸[28]，它们可以通过与金属离子络合形成有机配位化合物，从而降低金属离子的活性并固定化金属离子，降低其毒性。但是在八仙花的叶片部分，锌主要积累在细胞器部分，这是八仙花在锌胁迫处理时，光合作用降低的一部分原因。在本研究中铅锌协同胁迫处理时，八仙花细胞壁积累的铅减少，细胞可溶性部分的铅质量分数增加，原因是细胞壁上重金属的结合位点达到饱和，八仙花为了维持正常的生长，将细胞内的重金属转移并区隔化到液泡中。此外，铅锌协同胁迫处理时，八仙花各部位细胞器部分的重金属质量分数都有不同程度地减少，这也是两种金属协同胁迫会减轻单一金属毒害的机制之一。

4 结论

随着金属质量分数的增加，在形态上，八仙花的根系逐渐缩短，以减少重金属接触；在生理上，八仙花细胞的渗透调节物质增加以维持细胞结构，抗氧化酶活性增强以清除多余的活性氧，其中以过氧化物酶作用最为显著、类胡萝卜素质量分数增加以保护光合系统；在重金属积累上，八仙花将重金属大量积累在根部，避免向地上部位转移，在细胞内将重金属积累在活性低的区域(细胞壁、细胞可溶性部分)。

铅、锌对八仙花的作用有明显的不同之处：铅对八仙花的根系伤害大，锌对八仙花抗氧化酶系统、光合系统伤害大；铅主要积累在八仙花细胞的细胞壁部分，锌主要积累在细胞可溶性部分。

铅锌协同胁迫处理，增加了八仙花对铅、锌的吸收，却减轻了铅、锌对植物的毒害作用，即这两种金属在八仙花体内，具有吸收量上的相互促进、毒害作用上的相互减弱。

综合看，八仙花在铅锌胁迫时，表现出明显的“低促高抑”现象、一系列生理抵抗行为，表明八仙花对单一和复合的铅锌污染有一定抗性，具有植物稳定的潜力。