酪酸梭菌调控肠道菌群对DSS结肠炎的作用

沈媛媛 程 凯 张冉冉 刘成霞

1 滨州医学院附属医院消化内科 山东 滨州 256603;2 滨州医学院附属医院甲状腺外科 山东 滨州 256603

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)的发病机制尚不明确，可能是遗传易感性、由肠道菌群紊乱导致免疫炎症激活和肠黏膜屏障受损引起的，在其机制研究中最常用的模型是葡聚糖硫酸钠(dextransodiumsulfate，DSS)诱导结肠炎模型[1-2]。肠道常驻益生菌之一酪酸梭菌(Clostridiumbutyricum，CB)活菌及代谢产物短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)具有以下作用：调节益生菌与致病菌的比例，保持肠道菌群平衡；为肠上皮细胞提供能量，促进肠上皮增殖及修复；调节免疫细胞的功能，维持机体免疫平衡。CB在肠易激综合征、炎症性肠病、糖尿病、肿瘤等疾病的发生、发展中发挥其生物学效能[3-6]。肠道菌群中的脱硫弧菌(Desulfovibrio)在厌氧环境下可产生大量H2S，可破坏肠上皮完整性，在UC患者粪便中丰度明显升高[7]。因此，本研究通过观察CB对DSS结肠炎炎症程度及肠黏膜屏障的作用，探讨其对DSS结肠炎模型肠道菌群的影响，尤其是对脱硫弧菌可能的调控作用。

1 材料与方法

1.1 材料 30只健康6周龄雄性C57BL/6J小鼠，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供。本研究经滨州医学院动物伦理委员会审查通过。主要材料包括：DSS(分子量为36 000～50 000，MP biomedical公司)；CB活菌胶囊(国药准字号为S20040084，青岛东海药业有限公司)；MRS肉汤(货号为M8540，Solarbio公司)；ZO-1 Rabbit pAb(货号为A0659，ABclonal公司)、Occludin Polyclonal antibody(货号为27260-1-AP，Proteintech公司)；TNF-α ELISA试剂盒(Millipore公司)。

1.2 方法 随机将30只C57BL/6J小鼠分为3组，每组10只，在恒温环境下饲养。根据文献[8]，DSS结肠炎组和CB组小鼠均自由饮用3.5%(w/v)DSS溶液7 d，构建DSS结肠炎模型。此后，CB组小鼠用108 CFU CB活菌混悬液灌胃处理7 d。CB混悬液由CB活菌胶囊粉末于MRS肉汤培养基中厌氧培养并传代、纯化，小鼠灌胃前，用0.9%生理盐水稀释菌液至108CFU/mL，具体制备方法见参考文献[9]。正常对照组小鼠在常温下常规饲养。

1.3 监测指标 每日记录三组小鼠的体质量、有无便血及大便性状，按文献[10]所述方法采用DAI评分。收集三组小鼠处理14 d后的新鲜粪便，16V3-V4区设计引物进行粪便微生物群落多样性组成谱研究，由上海派森诺生物技术有限公司完成。取小鼠眼球血，静置1 min，3 000 r/min离心10 min，取离心的上清按照ELISA试剂盒说明书进行检测，用酶标仪450 nm波长测定OD值，计算肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF-α)浓度。收集血清后，立即颈椎脱臼处死所有小鼠，快速取出结肠组织，记录结肠长度，用4%多聚甲醛保存结肠组织后石蜡包埋切片，进行HE染色观察组织炎症程度，并采用免疫组化法测定组织中闭锁小带蛋白1(zonula occludens 1，ZO-1)(1∶400)和紧密连接蛋白Occludin(1∶400)含量。

2 结果

2.1 三组小鼠DAI评分和结肠长度的比较 与正常对照组相比，DSS结肠炎组小鼠在实验后均出现活动减少、反应迟钝，DAI评分升高，P<0.05。与DSS结肠炎组小鼠相比，CB组小鼠DAI评分下降，P<0.05。实验后解剖小鼠并测量结肠长度，与正常对照组小鼠相比，DSS结肠炎组小鼠的结肠长度缩短，P<0.05，而与DSS结肠炎组小鼠相比，CB组小鼠的结肠长度的结肠长度增加，P<0.05(表1)。

表1 三组小鼠DAI评分和结肠长度的比较

2.2 三组小鼠结肠组织学的变化 与正常对照组小鼠相比，DSS结肠炎组小鼠的结肠组织腺体损伤严重，隐窝结构明显异常，炎性细胞浸润明显。经CB灌胃治疗后，小鼠结肠组织炎性细胞浸润减轻，损伤的腺体及异常的隐窝结构减少(图1)。

A. 正常对照组；B. DSS结肠炎组；C. CB组。

2.3 三组小鼠血清TNF-α浓度的比较 与正常对照组小鼠相比，DSS结肠炎组小鼠的血清TNF-α浓度升高，P<0.05。与DSS组相比，CB灌胃小鼠的血清TNF-α浓度降低，P<0.05(图2)。

与正常对照组相比，*P<0.05；与DSS结肠炎组相比，#P<0.05。

2.4 三组小鼠结肠组织紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的比较 与正常对照组相比，DSS结肠炎组小鼠紧密连接蛋白ZO-1和Occludin均表达下调。而经CB活菌灌胃后，与DSS结肠炎组小鼠相比，CB组小鼠的结肠组织紧密连接蛋白ZO-1和Occludin均表达上调(图3)。

图3 三组小鼠结肠组织紧密连接蛋白ZO-1和Occludin表达的变化(×200)

2.5 三组小鼠粪便菌群的比较 与正常对照组小鼠相比，DSS结肠炎组小鼠粪便中脱硫弧菌属(Desulfovibrio)丰度增加。而与DSS组相比，CB灌胃小鼠粪便中的脱硫弧菌属丰度下降(图4)。

图4 三组小鼠粪便菌群物种组成热图

3 讨论

UC是一种病因和发病机制尚未完全阐明的慢性复发性肠道炎症，具有病程长、反复发作和进行性加重的特点。肠道慢性炎性反应可导致中毒性巨结肠、肠梗阻及结肠炎相关性结肠癌(colitis-associated colorectalcancer，CAC)的发病，严重威胁人类健康和寿命[11]。近年来，随着工业化及人们生活习惯的改变，UC的发病率逐年增高。关于通过DSS结肠炎模型探究UC的发病机制及药物治疗机制的研究也日益增多。UC患者的肠道菌群多样性减少，有潜在保护作用的细菌亚种减少，而有致病作用的细菌亚种增多[12-13]。脱硫弧菌(Desulfovibrio)是肠道内主要的硫酸盐还原菌(sulphate-reducing bacteria，SRB)，有鞭毛结构，在肠道厌氧环境下可产生大量H2S气体。过量的H2S可竞争性抑制肠道内环境中的短链脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)含量，干扰肠上皮细胞能量代谢，从而破坏肠黏膜屏障，这可能是导致UC发病的重要机制。CB属于肠道常驻益生菌，在厌氧状态下可酵解产生大量酪酸、醋酸等短链脂肪酸，这些成分可快速通过肠黏膜屏障，为肠上皮细胞提供能量，并调控Akt/mTOR、TLR/MyD88等信号通路，促进肠上皮细胞增殖及修复，是益生菌治疗UC的重要机制[14-15]。因此，研究CB调控脱硫弧菌为代表的肠道菌群改变对DSS结肠炎的作用机制有重要意义。

结肠长度和DAI评分是评估小鼠结肠炎炎症程度的重要指标。在本研究中，DSS结肠炎小鼠因结肠炎症致结肠挛缩，而经CB灌胃治疗后，DSS结肠炎小鼠的结肠短缩程度下降。在CB灌胃处理DSS结肠炎小鼠后，DSS结肠炎小鼠的DAI评分下降，这些均提示CB活菌可以明显减轻DSS小鼠的结肠炎症程度。本研究观察到DSS结肠炎小鼠结肠隐窝大量破坏，且存在大量浸润炎细胞，而经CB灌胃后DSS结肠炎小鼠的结肠粘膜层炎细胞浸润及隐窝破坏等病理表现均显著改善。

免疫系统紊乱是UC重要发病机制之一。以巨噬细胞、单核细胞和树突样细胞为主的经典固有免疫系统失衡和适应性免疫系统激活可以大量释放TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS、IL-12、IL-23等促炎细胞因子，诱导T细胞向Th1和Th17方向分化，识别TLR受体、激活NF-κB信号通路，促进炎症发生、破坏肠上皮屏障完整性，使肠道菌群环境紊乱，这种变化在急性结肠炎模型中最为常见[16-17]。下调TNF-α等促炎因子或上调IL-10、EGF等抗炎因子能够显著改善结肠炎炎症程度[18]。CB通过上调肠黏膜巨噬细胞中IL-10的表达来调控TLR/Myd88通路，并抑制急性结肠炎动物模型的炎症反应。本研究显示，DSS结肠炎小鼠血清中TNF-α较正常对照组小鼠明显增加，在CB活菌治疗7 d后显著下调了DSS结肠炎小鼠血清TNF-α的浓度。这提示，CB通过下调血清TNF-α水平显著抑制了DSS结肠炎的炎症程度。肠黏膜屏障破坏在UC的发病机制中具有重要作用。紧密连接蛋白主要由跨膜蛋白、外周膜蛋白和细胞骨架蛋白构成，其作为肠黏膜屏障的重要组成部分，能够调节肠黏膜屏障的通透性。ZO-1属于外周膜蛋白家族，主要维持紧密连接蛋白复合体的完整性，而Occludin蛋白是跨膜蛋白的主要成员，能够调控紧密连接蛋白的通透性、维持细胞极性[19]。DSS结肠炎小鼠结肠组织中的ZO-1和Occludin蛋白水平均显著下降。经CB治疗后，结肠组织中的ZO-1和Occludin蛋白则明显上调，这提示，CB具有上调结肠紧密连接、保护肠黏膜屏障的作用，进而抑制DSS结肠炎的炎症程度。

肠道菌群紊乱是UC发生发展的基础。UC患者硫酸盐还原菌含量较正常人群明显升高，扰乱了肠道中乳酸和硫酸盐代谢，侵袭性大肠杆菌、真菌增多。其代谢产物乙酸盐和H2S含量增多，而这些代谢产物可促使肠上皮细胞发生凋亡，甚至癌变[20]。脱硫弧菌作为主要的硫酸盐还原菌，是高通量测序中丰度较高的肠道菌群。本研究发现，与正常小鼠相比，脱硫弧菌在DSS结肠炎小鼠的粪便中含量增多，而CB处理DSS结肠炎小鼠后，小鼠粪便脱硫弧菌含量下降。因此，CB能够抑制脱硫弧菌增殖，减少H2S，保护肠上皮细胞活力和结构稳定，从而发挥抑制DSS结肠炎的生物学作用。

综上所述，CB可能通过下调脱硫弧菌属，有效保护了结肠组织紧密连接蛋白ZO-1和Occludin，降低了血清促炎因子TNF-α含量，具有抑制DSS结肠炎的生物学活性。这为从调控肠道菌群角度治疗UC提供了重要的理论依据，有很好的研究前景和社会效益。