党参根际土壤浸提液对其种子萌发和幼苗生长的影响

2022-09-07邱黛玉沈鹏瑞胡芳弟

江苏农业学报 2022年4期

林超，邱黛玉，陈垣，沈鹏瑞，胡芳弟

(1.甘肃省干旱生境作物学重点实验室，甘肃兰州 730070； 2.甘肃农业大学农学院，甘肃兰州 730070； 3.甘肃省中药材规范化生产技术创新重点实验室，甘肃兰州 730070； 4.西安利君制药有限责任公司，陕西西安 710000； 5.兰州大学药学院，甘肃兰州 730070)

党参为桔梗科多年生草本植物党参[Codonopsispilosula(Franch.)Nannf.]、素花党参[CodonopsispilosulaNannf.var.modesta (Nannf.)L.T.Shen]或川党参(CodonopsistangshenOliv.)的干燥根[1]。因其具有补气、养血的功效，也被称为“小人参”。近年来，随着市场需求的增加，在党参产区连作现象较为严重，而连作容易破坏土壤中的生物和化学循环的平衡，从而使土壤养分和酸碱度发生变化，进一步造成作物产量和品质的恶化[2-4]。有研究者发现三七连作土壤会显著降低三七种子发芽率，随着连作年限的增加三七幼苗各生长指标逐渐下降,化感作用是导致三七连作障碍的主要原因[5]。当归根际土壤水浸液也会严重抑制其种子萌发和幼苗生长[6]。

党参在长期连作状态下容易造成种内竞争激烈，自毒物质在土壤中过度积累，尤其是在植物根际容易形成高浓度的微环境，土壤理化性质、微生态系统受到严重干扰，导致土壤中有害病原菌增多，植物生长发育不良[7-9]。黄芪、当归、半夏等药用植物的栽培实践中病害严重，产量和质量下降，很大程度上影响了中药材产业的可持续性发展[10-12]。目前在党参化感作用的研究中，对于化感物质的鉴别较少。为此，本试验通过室内生物测量法研究党参根际土壤水浸液对自身生长变化和幼苗抗氧化酶系统的影响，通过气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)测定筛选出疑似党参化感自毒物质，为研究旱作农业区连作党参化感自毒机理提供思路。

1 材料与方法

1.1 试验材料

党参种子采购于当地药材市场，经甘肃农业大学农学院教授陈垣鉴定为党参(Codonopsispilosula)。试验用土壤为甘肃省陇南市宕昌地区重茬地的党参根际土壤，pH 8.16，速效钾 169.86 mg/kg，速效磷25.56 g/kg，硝态氮30.18 mg/kg，铵态氮18.01 mg/kg，有机质12.47 g/kg。取样时间为生长初期(5月30日)、繁殖期(7月29日)、收获期(9月28日)，采用五点法取样，取3个生长时期党参根际土壤，室温下阴干，过4号筛。

1.2 试验方法

1.2.1 材料处理采用双因素随机区组试验设计，根际土壤取样时间分别为：党参生长初期、繁殖期和收获期。精密称取经阴干过筛的党参各生长时期根际土100 g，加入到500 ml无菌去离子水中，振荡并浸泡48 h后于台式离心机上以3 600 r/min离心15 min。将上清液进行过滤，得到党参根际土壤浸提液母液(X1)，留存备用。将X1稀释2倍得到党参根际土壤浸提液X2,稀释4倍得到根际土壤浸提液X3，设置蒸馏水处理为空白对照(CK)。

1.2.2 种子发芽试验采用培养皿滤纸法，设置蒸馏水培养为空白对照(CK)，不同浓度根际土壤浸提液处理为处理组，共计10个处理，各3次重复，共30个培养皿。种子用15% NaClO3溶液浸泡消毒15 min，清水冲洗后放置于培养皿中，每皿各50粒。培养皿直径为90 cm，底部放置2层滤纸，然后加入各处理浸提液5 ml。光照培养箱的光照周期为12 h光照/12 h黑暗，光照度为4 000 μmol/(m2·s)，温度为25 ℃。定期补充相应浓度浸提液，维持滤纸湿润即可。

1.2.3 幼苗生长试验采用小杯法测定，将生长7 d的幼苗移至组培瓶中继续生长，并加入相应浓度的浸提液5 ml，继续放回上述培养箱中培养。第20 d，测定党参幼苗的茎长、根长和总鲜质量以及幼苗生理指标。采用Williamson等[13]的方法计算化感效应敏感指数(RI)，公式为：

C为空白对照指标的均值，T为处理组的均值。RI>0为化感促进作用，RI<0为化感抑制作用，|RI|可用于判断化感作用强度。

自毒综合效应(SE)：该值为种子发芽率、发芽势及幼苗根长、茎长、鲜重等各测定指标RI的平均值，SE>0为化感促进，SE<0为化感抑制，绝对值的大小表示化感作用强弱。

1.3 测定指标

发芽率=发芽种子数(第7 d)/供试种子数×100%；发芽势=发芽种子数(第5 d)/供试种子数×100%；茎长：从地上部分与地下部分的分界线开始，量至茎尖；根长：从地上部分与地下部分的分界线开始，量至根部最底端；鲜质量：每个处理3个培养皿中幼苗总鲜质量。

采用氮蓝四唑(NBT)光化学还原法测定超氧化物歧化酶(SOD)活性，采用愈创木酚法测定过氧化物酶(POD)活性，采用双组分分光光度法测定丙二醛(MDA)含量[14]。

1.4 自毒物质检测

自毒物质检测仪器为气相色谱三重四级杆串联质谱联用仪(Agilent 7000D)，毛细管柱为HP-5MS(30.00 m×0.25 mm×0.25 μm)。质谱条件：电子轰击(EI)源，轰击电压70 eV，扫描范围 m/z 35～600 amu，离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，载气为He，流量为1 ml/min。测试条件：进样口温度250 ℃，初始柱温50 ℃。以5 ℃/min程序升温至210 ℃，保持2 min。

对照NIST质谱数据库计算机检索系统分析质谱图，进行未知物的鉴定。采用峰面积归一法计算各成分相对含量。

1.5 数据处理

试验数据通过Excel 2019软件进行作图，SPSS 25.0进行方差分析(ANOVA)和显著性差异分析(Duncan’s法，α=0.05)。

2 结果与分析

2.1 党参生长对其根际土壤浸提液的响应动态

自毒综合效应指数(SE)反映化感自毒作用的强弱。从表1中可以看出，同一处理中党参生长表现出明显的浓度梯度效应，即随着浸提液浓度逐渐升高，其对党参种子萌发和幼苗生长的抑制作用增强，浸提液母液抑制作用最强。在同一质量浓度(浸提液母液)条件下，繁殖期∣SE∣>收获期∣SE∣>生长初期∣SE∣，表明党参幼苗生长在繁殖期根际土壤浸提液的处理下表现出较强的敏感性，对党参生长初期根际土壤浸提液敏感性较弱；党参茎长∣RI∣>根长∣RI∣，说明党参根际土壤浸提液对自身抑制作用主要体现在幼苗生长方面。综上所述，党参3个生长发育时期中，繁殖期根际土壤水浸液对其种子发芽和幼苗生理生长表现出较强的抑制作用，该作用与水浸液浓度呈同向增长。

表1 党参不同生长时期根际土壤浸提液对自身的自毒效应

2.2 根际土壤浸提液对党参幼苗抗氧化酶活性和MDA含量的影响

由图1可知，在党参自毒物质胁迫下，党参叶片SOD活性升高，而随着自毒物质的不断积累超出了植物自身调节范围，造成活性氧在植物体内过量积累，SOD活性降低，党参叶片在自毒效应下的抗氧化能力减弱。党参根际土壤浸提液对党参幼苗叶片SOD活性的化感效应存在浓度梯度差异，党参生长初期的根际土壤浸提液抑制作用表现为X1处理>X2处理>X3处理，繁殖期的根际土壤浸提液和收获期的根际土壤浸提液与生长初期的根际土壤浸提液表现相同；在同一浓度下各时期党参根际土壤浸提液对党参幼苗的抑制作用表现为繁殖期根际土壤浸提液>收获期根际土壤浸提液>生长初期根际土壤浸提液。分析发现添加不同时期党参根际土壤浸提液后党参幼苗叶片SOD活性变化呈现一定规律，繁殖期X1浓度根际土壤浸提液处理的党参幼苗SOD活性最低，说明对党参幼苗的损害作用最大，较对照降低了27.51%；生长初期X3浓度根际土壤浸提液处理的SOD活性最高，较对照升高了15.15%。

X1、X2、X3见表1注，CK为蒸馏水空白对照。同一生长时期根际土壤浸提液不同小写字母表示不同浓度处理间差异显著(P<0.05)。图1 党参不同生长时期根际土壤浸提液对党参幼苗SOD活性的影响Fig.1 Effects of rhizosphere soil extracts of C. pilosula at different growth stages on superoxide dismutase (SOD) activity of C. pilosula seedlings

党参幼苗POD活性对党参各生长时期根际土壤浸提液表现出不同的响应(图2)。与对照相比，在X3处理下党参不同生长时期根际土壤浸提液均能提高其幼苗POD活性，生长初期根际土壤浸提液X3处理下党参幼苗POD活性达到最高，为7.25 U/(min·g)；而在X1、X2浓度下党参不同生长时期根际土壤浸提液使党参幼苗体内POD活性降低，繁殖期根际土壤浸提液X1处理下党参幼苗POD活性降至最低，为3.85 U/(min·g)，说明在高浓度条件下党参幼苗的保护细胞受损，在党参自毒效应下的调节作用减弱。在同一浓度下党参不同生长时期根际土壤浸提液对其幼苗毒害作用表现为繁殖期根际土壤浸提液>收获期根际土壤浸提液>生长初期根际土壤浸提液，因此在党参生长初期产生的自毒胁迫较其他生长时期弱。

X1、X2、X3见表1注，CK为蒸馏水空白对照。同一生长时期根际土壤浸提液不同小写字母表示不同浓度处理间差异显著(P<0.05)。图2 党参不同生长时期根际土壤浸提液对党参幼苗POD活性的影响Fig.2 Effects of rhizosphere soil extracts of C. pilosula at different growth stages on peroxidase (POD) activity of C. pilosula seedlings

由图3可知，化感自毒物质能显著提高植物体内MDA含量，造成其活性氧过度积累，对植物产生毒害作用，不同生长时期党参根际土壤浸提液不同浓度处理的党参幼苗MDA含量变化表现一致。与对照相比，党参繁殖期根际土壤浸提液X1处理下，党参幼苗MDA含量高达1.104 6 μmol/g，说明高浓度党参根际土壤浸提液对植物的毒害作用较大。党参生长初期根际土壤浸提液处理下，与CK相对，X1、X2、X3处理MDA含量分别增长了67.60%、41.59%、26.09%；繁殖期根际土壤浸提液处理下，MDA含量分别增长了132.93%、108.28%、101.60%；收获期根际土壤浸提液处理下，MDA含量分别增长了71.59%、44.50%、6.79%。党参不同生长时期根际土壤浸提液X1、X2、X3处理下MDA含量均较对照高，说明党参叶片细胞膜受伤害程度随着浸提液浓度的增大不断增加。整体而言，党参不同生长时期根际土壤浸提液的自毒效应对党参叶片MDA含量的增大程度表现为繁殖期根际土壤浸提液>收获期根际土壤浸提液>生长初期根际土壤浸提液，表明党参繁殖期自毒物质分泌旺盛，对其自身的毒害作用较强。

X1、X2、X3见表1注，CK为蒸馏水空白对照。同一生长时期根际土壤浸提液不同小写字母表示不同浓度处理间差异显著(P<0.05)。图3 党参不同生长时期根际土壤浸提液对党参幼苗MDA含量的影响Fig.3 Effects of rhizosphere soil extracts of C. pilosula at different growth stages on malondialdehyde (MDA) content of C. pilosula seedlings

2.3 党参根际土壤中的自毒物质

GC-MS分析结果(图4、表2)显示，党参根际土壤浸提液中共发现异戊醛、甲酸、冰醋酸等13种物质，可能为党参化感自毒物质，其中相对含量较高的是5-羟甲基糠醛和冰醋酸，分别占全部组分的43.64%和24.12%，硝酸异山梨酯和糠醇所占比例最少，为0.54%。

图4 党参根际土壤浸提液的总离子流色谱图Fig.4 Total ion flow chromatogram of water extract from rhizosphere soil of C. pilosula

表2 党参根际土壤浸提液的化学组分

3 讨论

3.1 不同浓度党参根际土壤浸提液对党参的化感作用

植物经生物途径向根际环境释放化学信号，又由根系吸收贮存于植物体内，从而促进或抑制自身和种内植物的生长发育[15-16]。苏一诺等[17]用不同浓度的苜蓿器官和根际土壤浸提液处理苜蓿种子，其种子萌发和幼苗生长明显受抑，且抑制作用与浓度变化存在密切联系，根际土壤浸提液的抑制效应显著。霍鸿浩等[18]研究黄花蒿根、茎、叶不同浓度浸提液对小白菜和萝卜种子萌发的影响，认为其对两种蔬菜种子萌发均产生抑制作用，随着浓度的增加，抑制作用增强。在兰州百合、当归、核桃和多花黄精等作物的化感作用研究中也表现出类似的效应[19-22]。本试验通过研究党参不同生长时期、不同浓度根际土壤浸提液处理党参种子和幼苗，发现同一处理中党参幼苗生长抑制表现出明显的浓度梯度效应，随着浸提液浓度的增加，不同生长时期根际土壤浸提液对党参种子萌发和幼苗生长表现出持续抑制的现象。造成党参种子萌发受抑的原因可能为不同浓度根际土壤浸提液中化感物质影响植物细胞的分裂和分化，进而影响了种子发芽和幼苗生长，使植物根系吸水、吸肥能力降低，长势变弱。

3.2 根际土壤浸提液对党参相关酶活性的影响

SOD和POD可清除植物细胞中多余的活性氧[23-27]。长期处于活性氧胁迫下，膜功能及结构容易受损，抗氧化酶活性受到抑制[28]。不同浓度半夏浸提液对3种农作物玉米、萝卜和白菜SOD、POD活性的影响表现为低浓度促进，高浓度抑制，MDA含量与浸提液浓度呈正相关[29]。本研究结果表明，随着浸提液浓度变化，党参幼苗SOD和POD活性变化一致，在稀释4倍浓度下与对照未达到显著差异水平，浓度增大到稀释2倍和母液时与对照差异显著，与上述研究结论一致。原因可能是在外界低浓度自毒胁迫下，为应对短期内活性氧含量的迅速增加，党参抗氧化酶活性随之升高，以维持党参的正常生理代谢，而在高浓度自毒环境胁迫下，活性氧的代谢超过了党参的最大承受范围，抗氧化酶活性反而降低；MDA含量增加显示细胞膜结构和生理功能受到破坏，使得细胞内容物渗出、根系活力降低，最终抑制了党参幼苗的生长。

3.3 党参根际土壤中潜在化感物质

植物可以通过释放化感物质对周围植物产生毒害作用。有研究者发现，化感物质的种类和作物种类、释放途径存在密切关系，酚酸类和酯类物质是自毒物质的主要来源[30-31]。三七根系分泌物中酚酸类物质会积累在土壤中，对三七生长产生影响[32]。邻苯二甲酸和对羟基苯甲酸抑制玉米根长、芽长、根鲜质量[33]。胡颓子根系分泌物中共鉴定出33种物质，分为酸、酯、烃等7大类，这些组分中有21种化合物已经被证实是具有化感作用的物质[34]。本试验共检测出7类13种化学物质，主要以醛类、酸类为主，其中5-羟甲基糠醛和冰醋酸的相对含量最高，硝酸异山梨酯和糠醇相对含量最低。检测出的物质中冰醋酸为已知的酚酸类化感自毒物质，对植物种子萌发、植株生长、土壤酶活性和基本理化性质产生影响[35]。在后续的研究中对5-羟甲基糠醛和冰醋酸单体化合物进行了生物检测，测试其化感效应，结果显示两种物质均对党参植株生长产生抑制作用，说明5-羟甲基糠醛和冰醋酸可能为党参的化感自毒物质。