金黄色葡萄球菌体外刺激奶牛外周血中性粒细胞对炎性因子分泌的影响

张 凯，姜雪莹，钱英红，曹金山*，刘 博，张 静，毛 伟

(1.内蒙古农业大学兽医学院，内蒙古呼和浩特 010018；2.农业农村部动物疾病临床诊疗技术重点实验室，内蒙古呼和浩特 010018；3.内蒙古自治区农牧业科学院,内蒙古呼和浩特 010018)

金黄色葡萄球菌(S.aureus)简称金葡菌，是引发细菌感染性疾病的主要致病菌之一，奶牛乳腺炎、阴道炎、子宫内膜炎均与金黄色葡萄球菌密切相关[2-4]。金葡菌是革兰氏阳性菌，侵入机体能激活免疫细胞并诱导宿主炎症反应[5]。中性粒细胞是重要的免疫细胞,在炎症反应时可释放细胞因子、趋化因子和其他促炎介质，促进适应性免疫细胞(包括B细胞和T细胞)的募集和激活来启动和放大免疫反应。中性粒细胞的激活可通过不同因素诱发，其中细菌所释放的病原体相关分子模式(PAMPs)是激活中性粒细胞的主要因素[6]。中性粒细胞除了具有吞噬和杀菌特性外，还可能通过产生免疫调节细胞因子的能力，在革兰氏阳性菌感染的先天性免疫反应中发挥作用。人中性粒细胞在幽门螺旋杆菌的作用下分泌细胞因子IL-1β、IL-8、TNF-α以及IL-10[7]。大肠埃希氏菌感染中性粒细胞后，可以激活NF-κB信号通路，导致炎症因子TNF-α和IL-1的释放增加[8]。抗炎细胞因子IL-10是免疫反应的主要调节剂，但其在牛免疫启动初始阶段的细胞来源和功能尚未完全确定[9]。TNF-α是一种重要的炎症介质，它是潜在的中性粒细胞激活剂。TNF-α对多种细胞都有诱导凋亡作用，对中性粒细胞也是如此，而且与作用时间和作用浓度相关[10]。IL-8是一种具有很强趋化活性的细胞因子,能够促进中性粒细胞的活化和脱颗粒。由于对中性粒细胞很强的趋化活性,IL-8被认为在败血症的致病过程中发挥了重要作用[11]。然而奶牛中性粒细胞在金葡菌的作用下是否也可通过激活NF-κB信号通路从而分泌这些细胞因子的尚不清楚。因此，阐明由金黄色葡萄球菌感染引起的奶牛炎症发病机理对治疗奶牛相关疾病具有重要意义。

本研究用S.aureus(SA113)感染奶牛中性粒细胞，探讨NF-κB信号转导通路的激活情况和促炎细胞因子IL-1β、TNF-α，抗炎细胞因子IL-10和趋化因子IL-8在中性粒细胞上发生的炎症反应过程中是如何参与调节的。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物及菌株 选取4岁～6岁健康、泌乳期90 d左右的荷斯坦奶牛；试验用菌株金黄色葡萄球菌 SA113(ATCC 35556)由德国图宾根大学 Friedrich Götz 教授馈赠。菌株在MH液体培养基中扩增后，保存于-80℃冰箱。

1.1.2 试剂 胎牛血清和牛血清白蛋白BSA，Biosciences公司产品；MH培养基，OXOID公司产品；PBS磷酸盐缓冲液、RPMI1640基础培养基，Hyclone公司产品；牛IL-1β 、IL-10、IL-8 ELISA检测试剂盒，Kingfisherie Biotech公司产品; 牛TNF-α ELISA检测试剂盒，R&D Systems公司产品；牛外周血中性粒细胞分离试剂盒，天津灏洋公司产品。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱和水平离心机，Thermo Fisher公司产品；恒温振荡培养箱，培英公司产品；显微镜，Olympus公司产品；高压灭菌锅，松下公司产品；-80℃低温冰箱，海尔公司产品；超净工作台，Airtech公司产品。

1.2 方法

1.2.1 奶牛外周血中性粒细胞培养 选健康荷斯坦奶牛对其进行颈静脉采血50 mL。向15 mL的离心管中先加4 mL牛外周血中性粒细胞分离试剂盒里的分离液1，再取3 mL的新鲜抗凝血缓慢加于牛外周血中性粒细胞分离试剂盒里的分离液1上。2 000 r/min水平离心25 min。收集位于分离液界面上的白色层带的细胞放入15 mL离心管中。向新的15 mL的离心管中加入2 mL的分离液2，取白色层带的细胞3 mL,缓慢加于分离液2上，2 000 r/min水平离心40 min。弃去上清，收集细胞，加2 mL的红细胞裂解液，裂解2 min,用3倍体积的PBS溶液中和红细胞裂解液，1 000 r/min离心5 min。若还有红细胞可再裂解一次最后用含100 mL/L的胎牛血清的1640培养基重悬，计数约4.2×107个/mL细胞，培养置6孔板中。

1.2.2 奶牛中性粒细胞鉴定 用瑞氏姬姆萨染色方法对分离培养的奶牛中性粒细胞进行鉴定。取细胞悬液均匀的涂布于干净的载玻片上，待到载玻片上的细胞自然风干后，将染液滴到上面约2 min～3 min，后滴加PBS，染液和PBS比例约为1∶1.5。混匀后染色3 min～5 min,时间一到用PBS小心冲洗2遍，后用水对其进行冲洗。待载玻片自然干燥后，油镜下观察细胞形态。

1.2.3 奶牛中性粒细胞活性检测 称取台盼蓝粉末4 g,使用100 mL超纯水溶解,滤纸过滤，将其配置成0.4 g/L台盼蓝母液置于4℃保存。每次使用时用PBS稀释成0.04 g/L。将中性粒细胞按2×105接入96孔板中。时间点设置为0、6、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h。在对应的时间点分别用0.04 g/L的台盼蓝溶液与中性粒细胞悬液以1∶9的比例充分混合染色3 min～5 min。分别计数活细胞数和死细胞数，设置3次重复，在显微镜下观察染色情况，死细胞被染成明显的蓝色而活细胞拒染呈无色透明状。最后统计细胞活率：细胞活率(%)=(活细胞数/细胞总数)×100%

1.2.4 金黄色葡萄球菌复苏和制备 将金黄色葡萄球菌从-80℃拿出置于4℃直到完全融化，在超净台中将其放于100 mL MH肉汤中，将锥形瓶封口置37℃恒温摇床上200 r/min摇16 h后拿出。3 000 r/min离心6 min,弃上清，用无菌PBS对其进行重悬重复3次，最后一次用1640培养基对其进行重悬。

1.2.5 金黄色葡萄球菌浓度计算 吸取1 mL摇起来的菌液到1.5 mL无菌无酶离心管中，3 000 r/min离心6 min,弃上清，加入无菌PBS对其进行重悬。重悬后用PBS对菌液进行梯度倍比稀释，稀释度分别为101、102、103、104、105、106、107、108、109、1010。每个稀释度做4个平行，各取菌液100 μL均匀涂布于营养琼脂平板，倒置于37℃温箱中培养过夜。选择菌落数在30～300的稀释度来计数，取其平均值计算CFU 值，菌液4℃保存。

1.2.6 奶牛中性粒细胞细胞因子的释放和感染时间的关系确定 将分离培养的奶牛中性粒细胞接种于6 孔细胞培养板中(2×106个/mL)，根据前述试验中得到的金黄色葡萄球菌每毫升菌液中细菌的CFU值，以MOI 3∶1感染细胞。在37℃、5% CO2培养箱中孵育1 h，加入浓度为500 μg/mL 的硫酸庆大霉素溶液250 μL，使庆大霉素的终浓度达到100 μg/mL的水平。37℃继续孵育2、5、8、11、23 h。使其总感染时间达到3、6、9、12、24 h。

1.2.7 金黄色葡萄球菌感染奶牛中性粒细胞NF-κB信号通路的激活情况 将奶牛中性粒细胞接种于6孔细胞培养板中，每孔接5×106个/mL，根据前述试验中得到的金黄色葡萄球菌每毫升菌液中细菌的CFU值，以MOI 10∶1感染细胞。感染后的细胞在细胞培养箱中37℃孵育15、30、60、120 min后提蛋白。80V 40 min、110 V 90 min SDS-PAGE凝胶电泳后、半干转25V 30 min、0.3 g/L BSA封闭4 h、以1∶1000的比例稀释一抗孵育14 h、使用TBST洗膜4次，每次5 min、二抗1∶3 000稀释孵育1 h、洗膜4次，每次10 min。使用Supersignal west pico化学发光底物及化学发光成像系统采集图像。

1.2.8 ELISA检测 根据ELISA试剂盒说明书分别对不同细胞因子进行检测，绘制相应的标准曲线并计算样品中细胞因子浓度。

1.2.9 数据处理 用GraphPad Prism 5数据处理软件对试验结果进行数据统计及差异性分析，*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001。

2 结果

2.1 奶牛外周血中性粒细胞的鉴定

油镜下观察到奶牛外周血中性粒细胞细胞核呈马蹄铁形、分叶状或弯曲杆状，细胞核颜色为紫色，可见极浅的淡红色的细胞胞质，符合中性粒细胞的形态特征(图1)。

图1 奶牛中性粒细胞形态特征(1 000×)

2.2 台盼蓝拒染法检测中性粒细胞的活率

从分离培养细胞开始选择0、6、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h进行台盼蓝染色并进行细胞计数，计算细胞活力。培养时间在0 h～6 h活细胞比可达到100%，随着培养时间的增加细胞活率逐渐降低，在培养24 h以内细胞活率可达到98%以上，因此诱导细胞时间选择在0 h～24 h。

图2 奶牛中性粒细胞活性检测

2.3 S.aureus感染奶牛中性粒细胞因子表达的检测

金黄色葡萄球菌(SA113)以MOI 3∶1感染奶牛中性粒细胞，分别在感染3、6、9、12、24 h后收集奶牛中性粒细胞培养上清，用ELISA方法检测奶牛中性粒细胞上清中细胞因子IL-1β、TNF-α、IL-10以及IL-8的表达水平。与对照组相比，金黄色葡萄球菌(SA113)感染奶牛中性粒细胞3、6、9、12、24 h时上清中TNF-α、IL-10以及IL-8的分泌量极显著升高(***P<0.001)。IL-1β除了在3 h时与对照组相比差异不显著，其他时间点都差异极显著(***P<0.001)。与金黄色葡萄球菌(SA113)感染奶牛中性粒细胞9 h作用组相比较，奶牛中性粒细胞上清中TNF-α的分泌量降低，差异不显著(图3)。

***P<0.001，**P<0.05，nsP>0.05)

2.4 S.aureus感染奶牛中性粒细胞NF-κB信号转导通路激活情况

用金黄色葡萄球菌SA113以MOI 10∶1感染奶牛中性粒细胞，感染15、30、60、120 min后收集细胞提蛋白。根据Western bIot的相关步骤对其进行磷酸化检测。与对照组相比，SA113感染奶牛中性粒细胞15、30、60、120 min时IκBα的磷酸化水平都极显著高于对照组(***P<0.001)，且在15、30、60 min时磷酸化水平逐渐升高，在120 min时呈下降趋势(图4)。

图4 金黄色葡萄球菌感染奶牛中性粒细胞IκBα磷酸化激活情况

3 讨论

当细菌感染奶牛机体引发炎症反应时，中性粒细胞在趋化因子作用下可以第一时间募集到疾病发生位点。它们可以通过吞噬作用，在细胞内摄取和杀死入侵的微生物。中性粒细胞也可通过释放储存在颗粒中的抗菌肽和酶来杀死细胞外的微生物。除了抗菌功能，中性粒细胞还能够表达编码炎症介质的基因，如生长因子、趋化因子和细胞因子等[12]。人中性粒细胞在幽门螺旋杆菌的作用下分泌促炎细胞因子IL-1β、趋化因子IL-8、和TNF-α以及抗炎细胞因子IL-10[7]。大肠埃希氏菌感染中性粒细胞后，可以激活NF-κB信号通路，导致炎症因子TNF-α和IL-1的释放增加[8]。因此，初步可以认为革兰氏阴性菌感染中性粒细胞时，可以激活炎症信号通路从而导致炎症因子的释放。

本研究通过金黄色葡萄球菌感染奶牛中性粒细胞，检测IκBα磷酸化水平，同时检测促炎细胞因子IL-1β、趋化因子IL-8、和TNF-α以及抗炎细胞因子IL-10的分泌。研究结果显示，在成功分离培养奶牛中性粒细胞的基础上，金黄色葡萄球菌(SA113)感染后能够激活NF-κB信号通路，进而提高促炎细胞因子IL-1β、趋化因子IL-8、和TNF-α以及抗炎细胞因子IL-10的分泌，且细胞因子的分泌与时间具有时效关系。说明革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌通过奶牛中性粒细胞的某些受体的识别下，通过激活NF-κB炎症信号转导通路从而导致炎症细胞因子分泌上升，而不同的是随着感染时间增加，TNF-α表达量不发生显著变化，且略有下降的趋势。而且据报道称中性粒细胞的寿命很短，它被认为只能在骨髓外存活几个小时后就会被吞噬和清除[13]。血液中中性粒细胞的寿命为5.4 d，比以前发现的长20多倍[12]。本试验发现中性粒细胞在前3 d细胞活率可以达到85%以上，到第5天时细胞活率只有52%。随着中性粒细胞寿命的显著延长，可以预见中性粒细胞还能够发挥更多的生物学效应。TNF-α可以促进中性粒细胞的死亡，可能是由于时间的延长中性粒细胞可能处于一个自我保护的阶段，导致中性粒细胞分泌TNF-α的能力也在下降。

中性粒细胞内含有大量溶酶体酶，可以快速的将吞入细胞内的细菌和组织碎片分解[14]。综上所述，牛中性粒细胞除了具有吞噬和杀菌特性外，还可能通过其产生免疫调节因子的能力，在革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌感染的先天性免疫应答中发挥重要作用。