乌头碱致HT22细胞凋亡的研究

刘奕伶，唐丽辉，赵文星，王 辉，郭梓豫，吴可欣，张云昊，莫重辉，赵宝玉，路 浩*

(1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100；2.青海大学农牧学院，青海西宁 810016)

乌头(Aconitum)为毛茛科多年生草本植物，该属植物大部分块根内含有剧毒乌头碱，因此被列为有毒植物[1]。近年来我国牧区乌头等毒草大量滋生，家畜误食后中毒，对畜牧业发展造成极大危害[2-3]。乌头属有毒植物中含有多种毒性成分，主要为二萜类生物碱，常见的有乌头碱(aconitine)、中乌头碱(mesaconitine)、次乌头碱(hypaconitine)、异乌头碱(isoaconitine)等，其中乌头碱毒性最强[4]。动物中毒后临床表现为流涎、呕吐、腹痛、瞳孔散大、呼吸困难、运动中枢和感觉麻痹等[5]。

乌头碱的研究主要集中在药理作用方面，如强心[6]、抗炎[7]、抗肿瘤[8]、抗衰老及抗病毒[9]等，对其毒理研究较少。乌头碱的毒性主要是影响心脏、中枢神经系统和肌肉组织[10]。通过与生物膜上的脂质或蛋白质反应，刺激细胞促凋亡基因的表达增加，诱导动物组织细胞凋亡[11]。其在心肌细胞中促凋亡有剂量依赖性，通过p38/MAPK信号通路引起大鼠心律失常[12]，通过线粒体、内质网通路等诱导细胞凋亡[13]。本研究以小鼠海马神经细胞(HT22)为研究对象，探讨乌头碱体外对HT22细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞来源 HT22细胞，北京北纳创联生物技术研究院(BNCC)提供。

1.1.2 主要试剂 胎牛血清(FBS)和DMEM培养基，Gibco公司产品；胰蛋白酶和青链霉素，Hyclone公司产品；Annexin V-FITC/PI和Hoechst 33258，Solarbio公司产品；乌头碱(纯度98.36%)，成都曼思特生物科技有限公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 电子天平PTI-FA110，福州华志科学仪器有限公司；79-2双向磁力加热搅拌器、PHS-3E型酸度计和三用水箱，北京科伟公司；YI-CJ-IN型超净工作台，北京亚泰科隆公司；CKX31型倒置显微镜，日本Olympus公司；EPOCH酶标仪，美国BioTek公司；CO2恒温培养箱，美国Thermo Fisher Scientific公司；Axio Observer倒置荧光显微镜，德国Zeiss公司；BD-FACSAria型流式细胞仪，美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠海马神经细胞复苏与培养 冻存的HT22细胞于37℃水浴解冻，用DMEM完全培养基于37℃、体积分数为5%的CO2培养箱中培养，待细胞铺满培养皿底部80%时传代并进行细胞计数。

1.2.2 小鼠海马神经细胞存活率测定 取对数生长期细胞，按常规方法制成细胞悬液，以1.5×103个/孔均匀接种至96孔板中，设不加细胞的调零孔，置于37℃、体积分数为5% CO2饱和湿度培养箱中预培养，待细胞进入对数生长期，用乌头碱分别处理HT22细胞6 h和12 h。试验分阴性对照组为HT22细胞、培养液、无药物；处理组为HT22细胞、培养液、乌头碱(0、50、100、200 μg/mL)。按照MTT试剂盒说明检测细胞存活率(将含有乌头碱的培养液吸弃，每孔加入含5 g/L的MTT培养液，4 h后将培养液吸弃，每孔加入100 μL二甲基亚砜，低速振荡10 min后用酶标仪OD490 nm测吸光度值)，细胞存活率=(处理组OD值-调零孔OD值)/(阴性对照组OD值-调零孔OD值)×100%。

1.2.3 小鼠海马神经细胞核荧光染色 取对数生长期的细胞，按常规方法制成细胞悬液，4.5×104个/孔均匀接种至6孔板中，设不加细胞的调零孔，置于37℃、体积分数为5% CO2饱和湿度的培养箱中预培养，待细胞进入对数生长期，用乌头碱分别处理HT22细胞6 h、12 h。试验分组同1.2.2，按照Hoechst 33258试剂盒说明对细胞核染色(将含有乌头碱的培养液吸弃，加入Hoechst固定液0.5 mL，37℃孵育20 min后吸弃，PBS缓慢振荡漂洗3次，加入Hoechst 33258染色液0.5 mL，继续孵育5 min后吸弃)，用荧光显微镜对HT22细胞进行凋亡形态学检测。

1.2.4 小鼠海马神经细胞凋亡率测定 取对数生长期细胞，按常规法制成细胞悬液，以1.0×105个/皿的细胞密度均匀接种至60 mm细胞培养皿，在培养箱中预培养，待细胞进入对数生长期，用乌头碱分别处理HT22细胞6 h、12 h。试验分组同1.2.2，按照Annexin V-FITC/PI试剂盒说明对细胞进行染色(收集细胞，PBS洗涤后重悬，使细胞密度达1×106个/mL，每管加入100 μL细胞和5 μL Annexin V-FITC，室温避光，轻轻振荡10 min，加入5 μL PI，室温避光孵育5min，加入PBS至500μL，轻轻混匀)，用流式细胞仪检测HT22细胞凋亡率。

1.2.5 数据分析 用SPSS20.0软件对数据进行方差分析，P<0.05差异显著，P<0.01差异极显著。

2 结果

2.1 乌头碱对小鼠海马神经细胞存活率影响

不同浓度乌头碱处理HT22细胞6 h、12 h，MTT法检测细胞存活率，乌头碱抑制细胞生长有时间-剂量依赖性。与对照组相比，50 μg/mL乌头碱作用6 h对细胞存活率无影响，其余剂量和作用时间细胞存活率均极显著降低(P<0.01)(图1)。

与各自空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01 *P<0.05,**P<0.01,compared to the control group

2.2 乌头碱对小鼠海马神经细胞核的影响

不同浓度乌头碱的细胞染色后，荧光显微镜可见对照组细胞核为蓝色，圆形或卵圆形，呈弥散均匀荧光；试验组细胞核有不同程度的致密浓染，部分呈颗粒状、碎块状、边集呈新月形(图2)。

A.6 h，0 μg/mL；B.6 h，50 μg/mL；C.6 h，100 μg/mL；D.6 h，200 μg/mL；E.12 h，0 μg/mL；F.12 h，50 μg/mL；G.12 h，100 μg/mL；H.12 h，200 μg/mL

2.3 乌头碱对小鼠海马神经细胞凋亡率的影响

图3中左下象限Q4代表正常活细胞，Annexin V-FITC-/PI-；右下象限Q3代表早期凋亡细胞，Annexin V-FITC+/PI-；右上象限Q2代表坏死细胞或晚期凋亡细胞，Annexin V-FITC+/PI+；左上象限Q1代表细胞收集过程中出现的损伤细胞，V-FITC-/PI+。从图3可以看出，用不同浓度(0、50、100、200 μg/mL)乌头碱处理HT22细胞6 h或12 h后，在相同时间下，不同浓度乌头碱处理组的正常细胞比例明显下降，凋亡细胞比例显著上升(P<0.05)；随乌头碱浓度的增加，凋亡的HT22细胞显著增加，呈现明显剂量-效应关系(图4)。

A.6 h，0 μg/mL；B.6 h，50 μg/mL；C.6 h，100 μg/mL；D.6 h，200 μg/mL；E.12 h，0 μg/mL；F.12 h，50 μg/mL；G.12 h，100 μg/mL；H.12 h，200 μg/mL

与各自空白对照组相比，*P<0.05，**P<0.01 *P<0.05,**P<0.01,compared to the control group

3 讨论

乌头碱可使中枢神经系统及周围神经先兴奋后麻痹，影响细胞内离子和神经递质的浓度，阻止冲动的发生和传导，从而损害细胞形态和功能[14]，造成呼吸困难、全身麻木、意识模糊、反应迟钝、阵发性抽搐等症状[15]。乌头碱作用于心肌细胞，使心室内异位起博点的兴奋性增高和产生折返激动，形成单源或多源多形室性早搏、室性心动过速、心室颤动等[11,16]。 乌头碱也可引起细胞凋亡[17]。用乌头碱给大鼠灌胃后，大鼠心肌细胞、肝细胞、肾小管上皮细胞等均发生凋亡；细胞凋亡的典型变化包括细胞皱缩，DNA片段化，染色质高度浓缩，细胞核内缩、碎裂、形成新月形，细胞膜内陷和线粒体分解等[18]。Annexin V/PI双染法可用于检测凋亡的细胞，Annexin V是Ca2+依赖性的磷脂结合蛋白，能够与细胞凋亡时外翻至细胞膜外的磷脂酰丝氨酸(PS)结合，Annexin V标记上FITC，可用荧光显微镜进行观察；PI是一种依赖膜通透性的染料分子，通过FITC和PI的联合使用，可有效检测细胞凋亡的发生。

本研究用DNA特异性染料Hoechst 33258对HT22细胞进行染色，荧光显微镜观察HT22细胞核的形态学变化，结果显示各处理组细胞核均有不同程度的致密浓染，核固缩、核碎裂、部分呈颗粒状、碎块状、边集呈新月形等凋亡细胞特征，不同浓度乌头碱可引起HT22细胞发生凋亡。用Annexin V/PI处理HT22细胞不同时间后，用流式细胞仪检测发现，乌头碱致HT22细胞凋亡呈明显剂量-效应关系，随着处理时间的延长，HT22细胞的凋亡率呈下降趋势。乌头碱可通过清除线粒体活性氧达到保护细胞的目的[13]，可能是乌头碱致HT22细胞损伤过程中触发了某种机制，如自噬、氧化应激等，对细胞凋亡起到拮抗作用，逆转了部分凋亡[19]。

乌头碱可以引起HT22细胞凋亡，在HT22细胞凋亡中是否有自噬、坏死等及乌头碱引起HT22细胞凋亡的信号转导通路还有待进一步研究。