房水中IL-6、TNF-α和VEGF的变化与糖尿病性黄斑水肿的相关性研究

朱澜澜 高自清 戴青

糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema，DME)是糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)比较多见的表现。DME会使患者的视力下降，最严重可导致中心性视力丧失甚至是失明[1]，使其生活质量大幅度降低。在DME的发病机制中，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)有着十分重要的作用，可导致糖尿病视网膜病变的血管生成和血管通透性增加。因此，针对DME的抗VEGF治疗已作为改善DME患者视力的重要手段[2，3]。玻璃体腔内注射抗VEGF药物不仅可以显著改善DME患者的视力，还能逐渐恢复视网膜生理层的解剖结构。在众多随机试验中，其长期有效性和安全性已得到证实[4-7]。越来越多的证据表明炎症也在DR的发病当中扮演着重要角色[8]。有研究表明，DR患者玻璃体和房水中的白细胞介素(如interleukin-1、IL-6、IL-8)浓度均显著升高[9-14]。与IL-6和IL-8一样，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor -α，TNF-α)是一种促炎细胞因子，可以破坏血-视网膜屏障通过损坏视网膜血管内皮细胞和视网膜色素上皮细胞的紧密连接，从而参与糖尿病的发病机制[15]。目前关于房水中IL-6、TNF-α与DME相关性的研究相对不多，本研究主要是分析玻璃体腔内注射抗VEGF药物康柏西普( intravitreal conbercep injection，IVC) 前后DME患者前房水中 IL-6、TNF-α和VEGF浓度的变化，探讨IL-6、TNF-α和VEGF与DME发病的相关性，并研究玻璃体内注射康柏西普对血管生成和炎症细胞因子的影响。

资料与方法

一、研究对象

前瞻性病例研究。本试验纳入蚌埠医学院第一附属医院眼科2020年7月至2021年7月收治的DME患者40例(40只眼)作为研究对象，所有DME患者均接受0.05ml康柏西普(成都康宏生物科技有限公司)玻璃体腔内注药术，每位患者均符合此次试验纳入标准，在此基础上充分了解本研究的目的及方法后，均自愿参与本研究并签署手术知情同意书。其中DME患者男性22例，女性18例，年龄(64.3±10.3)岁，平均病程(11.5±5.3)年，平均血红蛋白A1c水平(7.9±1.4)%。

纳入标准： (1)散瞳后经前置镜查眼底等眼科专项检查确诊为DME，且治疗前及随访期间眼部检查资料完整；(2)相干光层析成像术(optical coherence tomography，OCT) 提示黄斑中心凹厚度(central macular thickness，CMT) >250μm；(3)荧光素眼底血管造影(fluorescein fundus angiography，FFA)检查提示黄斑区荧光素渗漏；(4)男女不限；(5)有糖尿病史。排除标准：(1)近6个月内曾接受过眼科手术，如青光眼手术、视网膜激光光凝术、玻璃体腔内注药术等；(2) 由DR以外的其他眼底疾病如年龄相关性黄斑变性、视网膜静脉阻塞、高度近视等引起的黄斑水肿； (3)伴有其他眼部疾病，如青光眼或高眼压症以及眼部炎性疾病等； (4)依从性差，不同意进行取样及房水检测及随访期间眼部检测资料不全者；(5)全身情况差无法进行手术者。

二、方法

1.术前准备：术前所有DME患者均被告知本研究目的、手术过程中以及可能出现的术后并发症等情况，并进行全身及眼部相关检查，排除恶病质及手术禁忌证。术前3 d术眼应用左氧氟沙星滴眼液(参天制药<中国>有限公司，国药准字 J20150106，规格：5 ml∶24.4 mg/支)，4次/d; 术前剪睫毛、冲洗泪道、0.9%氯化钠注射液15 ml冲洗结膜囊，以预防感染。

2.标本采集及治疗方法：在眼科专用无菌手术间手术，患者取仰卧位，用奥布卡因(参天制药<中国>有限公司，国药准字J20160094，规格：20 ml∶80 mg/支)滴眼液点术眼行表面麻醉，消毒，铺巾，贴膜，放置开睑器，5%聚维酮碘浸泡结膜囊，予以生理盐水冲洗结膜囊，将带有1 ml(0.45×16 mm)注射器针头于角膜缘内1 mm行前房穿刺，采集房水0.1 ml。将房水样品收集于无菌EP管中，并尽快冷冻，放置在-80 ℃冰箱保存。房水采集后立即抽取康柏西普注射液 0.05 ml( 0.5 mg) ，在颞上方距角膜缘4 mm处，垂直于巩膜面进针，将药物缓慢推入玻璃体腔，注射完毕后，湿棉签按压30 s，无菌敷料遮盖患眼。术后予以左氧氟沙星滴眼液滴眼液点眼( 4次/d) 1周局部抗炎治疗，预防感染。DME患者一般采用3+PRN 的治疗方案，首次行IVC治疗，1个月后根据复查时眼底情况再决定是否治疗，若复查时OCT显示视网膜仍存在黄斑水肿伴 CMT≥250 μm 或视力下降 2 行及以上，则需再行IVC治疗，在行IVC之前再次对所有患者的房水进行取样。本研究纳入患者经复查后均再次行玻璃体腔药物注射术。IVC及房水标本的收集均由同一位具有丰富临床操作经验的高年资医生进行。

三、房水因子检测

应用酶联免疫吸附检测技术，检测房水样本中IL-6、VEGF与TNF-α水平，试剂盒及配套试剂均采购自杭州联科生物科技公司(MULTI SCIENCES)，所有步骤均严格根据说明书进行操作。

四、眼科检查

所有DME患者分别于两次IVC术前进行最佳矫正视力( best corrected visual acuity，BCVA) 和黄斑中心凹厚度(central macular thickness,CMT)检查。BCVA 采用国际标准视力表检测，将小数视力换算为最小分辨角对数视力( logMAR)形式记录，以便进行统计分析。CMT采用OCT(科林 OPTOVUE OCT-2000) 测量。随访6个月，观察患者是否发生并发症。

五、统计学分析方法

结 果

一、DME患者IVC术后CMT和BCVA改善情况

首次IVC治疗后，DME患者BCVA(0.55±0.34)较术前(0.71±0.30)改善较明显，平均基线CMT为(479±116)μm，治疗后1个月降至(375±84)μm，差异均有统计学意义(t=3.532、4.126，均P<0.05)。

二、DME患者房水因子的变化

DME患者经IVC治疗后，房水中IL-6和VEGF浓度较均出现显著降低，差异有统计学意义(t=3.875、5.614，均P<0.05)。而TNF-α在IVC治疗后未见明显改善，差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 40例(40只眼)DME患者治疗前后房水细胞因子水平比较

三、术前DME患者房水中IL-6、VEGF浓度与CMT的相关性

术前DME患者房水中 IL-6 和VEGF 浓度均与 CMT 呈正相关(r=0. 652、 0. 847，均P<0. 05)，表明随着IL-6和VEGF的表达升高，CMT增厚。而术前患者房水中IL-6 与 VEGF浓度亦呈正相关性(r=0.677，P=0.001)。

四、DME患者房水中VEGF与CMT和BCVA的相关性

VEGF水平的降低与第1次IVC治疗1个月后CMT的降低和BCVA的改善有关。VEGF水平与CMT呈显著正相关(r=0.531，P=0.016)。VEGF水平与BCVA无相关性(r=0.208，P=0.197)。CMT水平与BCVA无相关性(r=0.054，P=0.742)。

五、典型病例

患者男性，67岁。诊断为DME，患者BCVA、CMT和VEGF浓度术前分别为1.10、702μm和487.24 pg/ml，术后分别为0.90、384 μm和268.52 pg/ml。见图1～2。

图1 首次IVC术前OCT检查所见

图2 第2次IVC术前OCT检查所见

六、患者术后并发症情况

随访期间，患者术后出现结膜下出血3例(3只眼)，未予以处理，自行吸收，均未出现高眼压、前房炎症反应、角膜水肿等并发症及全身不适。

讨 论

近年来，抗VEGF药物在世界范围内用于治疗DME的研究越来越多，这些药物已成为DME的一线治疗方法[5]。目前有许多抗VEGF药物，如贝伐单抗、雷珠单抗、阿柏西普和康柏西普，而这些药物在治疗DME的能力方面显示出一些细微的差异。康柏西普是一种完全人源化的可溶性VEGF受体(VEGFR)蛋白，其由VEGFR-1的胞外区-2和VEGFR-2的胞外区-3和4与人免疫球蛋白G1的Fc部分结合组成。在临床前试验中，相比于贝伐单抗、雷珠单抗和阿柏西普，在结合VEGF的能力方面康柏西普更占优势。康柏西普对PIGF的亲和力也很高，而PIGF在增加血管通透性、促进新生血管成熟和增强免疫炎症反应中发挥重要作用[16]。胎盘生长因子(placenta grouth factor,PlGF)是一种促血管生成因子，也是VEGF家族的成员，它可以作为VEGFR-1的特异性配体来调节炎症反应，通过刺激组织因子的产生和增强单核细胞/巨噬细胞的趋化性[17]。在与VEGFR-1结合后，PlGF还可以通过钙调神经磷酸酶依赖性途径来增强单核细胞的表达从而产生促炎因子[18]，表明它可能对炎症反应有直接影响。康柏西普通过与PIGF两侧的紧密结合，阻止它与其他分子相互作用，进而控制眼内的炎症发展。在本研究发现，DME患者IVC术后CMT与BCVA较治疗前均明显改善，表明康柏西普可以显著提高糖尿病视网膜病变患者的视力和减轻黄斑水肿，这与之前的临床研究一致[6]。

众多研究表明，DME是由炎症细胞因子和VEGF介导的，它们的作用是相互关联的[19，20]。在本研究中，我们发现DME患者行首次康柏西普治疗后房水中IL-6、和VEGF水平均显著降低。IL-6是一种功能广泛的多效性细胞因子，不仅能够诱导分化B 淋巴细胞、T 淋巴细胞，参与炎症发生，还能促进新生血管形成[21]。我们还发现，IL-6浓度与 CMT 呈正相关，这表明DME患者在视网膜缺血、缺氧的情况下会增强眼内液中IL-6 表达，进一步加重黄斑水肿。VEGF是一种特异性很高的促血管内皮生长因子，在它的作用下能使血管通透性增加，并与新生血管有关[22，23]。大量的临床研究表明，抗VEGF治疗改善了DME[24-26]。建议使用抗VEGF药物作为治疗DME的一线药物[27]。我们的结果表明，炎症因子和VEGF在DME的发生发展中起着重要作用，这些结果与以前的研究结果一致[28]。

TNF-α是一种来源于宿主的诱导肿瘤坏死的因子，它是对内毒素的反应而产生的，其能调节多种生物学功能，紊乱的TNF-α信号与多种疾病有关。虽然TNF-α主要是由激活的巨噬细胞产生的，但它在多种细胞中都有表达[29]。康柏西普与PIGF有较强的亲和力，而PIGF在炎症发展中能够发挥积极作用，因此在我们的预期结果中，在IVC术后TNF-α浓度会发生一定程度的下降。然而，这次研究发现，在IVC术后DME患者房水中TNF-α水平基本无明显改变。基于这一结果，我们推测一定浓度的康柏西普可以使TNF-α含量降低，在IVC术后1个月期间，药物浓度在眼内逐渐降低后，对TNF-α基本没有影响。这一发现表明，虽然IVC治疗DME患者有相当大的益处，但康柏西普对炎症介质的影响似乎有限。因此，综合治疗似乎是合理的，以提高治疗效果。

我们还发现DME患者IL-6与VEGF的基线水平成正相关，这与之前的研究一致[9]。然而，我们没有观察到DME患者房水中VEGF与TNF-α的基线水平之间的相关性。因此，DME中VEGF水平与炎症因子的关系有待进一步研究。这些发现提示进一步研究炎症因子、血管内皮生长因子和细胞因子在DME中的关系具有重要意义，这些因素可能有助于更好地了解和治疗DME。这项研究的另一个发现是，在DME患者接受第一次IVC治疗1个月后，VEGF水平的下降与CMT的下降有关。IVC治疗后CMT和VEGF水平直接相关的证据突出了OCT参数对指导VEGF抑制治疗和再治疗方案的价值。

综上所述，IL-6和VEGF浓度的变化与DME的发生发展密切相关，玻璃体腔内注射康柏西普后可使IL-6和VEGF的表达降低，CMT变薄，黄斑区水肿减轻，视力得到改善。