侵染白术的大豆花叶病毒的全基因序列测定及分析

马振男， 崔丽艳， 张 丽， 王舒婷， 王德富*， 牛颜冰*

(1)山西农业大学生命科学学院，山西 太谷 030801；2)山西农业大学草业学院，山西 太谷 030801)

白术(AtractylodesmacrocephalaKoidz)为菊科(Asteraceae)苍术属的多年生草本植物。早在2 000多年前的《神农本草经》中就已经将其列为上品药。现代研究进一步发现，白术富含挥发油、多糖、内酯类等化学成分，具有抗肿瘤、抗炎、调节消化系统等药理作用[1]。随着白术在现代临床应用和中成药生产等方面的不断需求，其种植面积也不断扩大，病虫害也随之增多，使得药材产量和质量均受影响。病害防治研究是保证药材质量及产量的关键之一，在影响白术生长的诸多病害中，病毒病害始终占据主导地位，因此，迫切需要对白术田间病害进行调查研究。

大豆花叶病毒(soybeanmosaicvirus, SMV)，是马铃薯Y病毒属(potyvirus)最典型的成员之一，其基因组为被外壳蛋白(coat protein, CP)所包裹的长约10 kb的正义单链RNA；在基因组RNA的5′-末端为共价结合基因组连接蛋白(viral protein genome-linked, VPg)，3′-末端则是多聚腺苷酸尾[2]。SMV基因组具有2个开放阅读框(open reading frame, ORF)，其中一个ORF可翻译形成一个多聚蛋白，后经自身编码的具有蛋白酶功能的第一蛋白(first protein, P1)、辅助组分蛋白酶(helper component-proteinase, HC-Pro)，以及核内含体蛋白a-蛋白酶(nuclear inclusion protein a proteinase, NIa-Pro)切割形成10个不同功能的成熟蛋白质，从N-端到C-端分别为P1、HC-Pro、第3蛋白(third protein, P3)、第1个6K蛋白(6-kilodalton protein 1, 6K1)、圆柱形内含体蛋白(cylindrical protein, CI)、第2个6K蛋白(6-kilodalton protein 2, 6K2)、核内含体蛋白a-基因组结合蛋白(nuclear inclusion protein a viral genome-linked protein, NIa-VPg)、NIa-Pro、核内含体蛋白b(nuclear inclusion protein b, NIb)和CP[3]蛋白。另一个ORF为移码翻译产生的PIPO(pretty interesting potyviridae ORF)蛋白(包含在P3蛋白中)[4]。

SMV的自然寄主范围极其有限，主要侵染以大豆为主的部分豆科植物[5-7]，但是之后又有研究者发现SMV可侵染天南星科植物半夏[8-9]。SMV感染植株后会影响植株的正常生长发育，感病植株常出现顶枯和矮化现象，叶片则表现皱缩、黄化、花叶等症状[10]。本课题组在对白术进行田间调查时，发现一株疑似感病白术(见Fig.1)，并对其进行非序列依赖性扩增(sequence-independent amplification, SIA)检测。结果表明，侵染白术的病毒病原为SMV，并将其命名为SMV-Am分离物。在此基础上，本文对侵染白术的SMV进行全基因组扩增，并对其序列相似性、进化关系、突变位点及重组事件进行分析，为防范SMV病害在白术上爆发流行及防治提供科学依据，并为明确SMV跨科侵染的分子机制研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

自然发病具有典型花叶症状的白术叶片(见Fig.1(A)健康的植物。(B)感染的植物)采集于河北省白术种植基地，液氮速冻后于-80 ℃贮存备用，主要试剂见Table 1。

Fig.1 Healthy and infected field symptoms of Atractylodes macrocephala Koidz (A)Healthy plants.(B)Infected plants

1.2 dsRNA提取与SIA检测

取-80 ℃冰箱保存的疑似感病白术叶片10 g，按照已报道的方法[11-13]进行dsRNA提取，之后以所提dsRNA为材料参考牛颜冰等人[14]的方法进行SIA检测。

1.3 SMV-Am全基因组扩增

根据GenBank中已登录的SMV基因组保守序列，使用Primer Premier 5.0 软件设计用于SMV-Am基因组全长扩增的11对特异引物及RACE引物(Table 2)，相邻片段之间无缝隙。再以所提白术dsRNA逆转录cDNA为模板，结合11对特异引物，使用Taq DNA polymerase进行PCR扩增，反应体系与反应条件参考牛颜冰等[15]的方法进行。cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends, RACE)采用巢式PCR的方法进行。其中，GSP和NGSP分别为一步和二步PCR反应所用引物，步骤按照SMARTer®RACE5′/3′Kit说明书进行。最终得到包含SMV-Am全基因组的11个特异片段和2个RACE扩增产物，将以上片段分别连接pMD18-T载体后导入大肠杆菌DH5α感受态细胞，阳性克隆通过菌落PCR鉴定后送至上海生工生物有限公司进行测序。

Table 1 Main reagents

Table 2 Primer pairs for SMV-Am whole genome amplification

Table 3 Comparison of nucleotide and amino acid sequence homology of SMV-Am and other 100 SMV isolates

1.4 SMV-Am生物信息学分析

对测序所得序列用DNAstar软件包中的SeqMan程序进行拼接，EditSeq程序进行修改和保存以获得SMV-Am全长基因组序列，并利用在线软件ORF finder用于预测核苷酸编码的氨基酸序列；DNAMAN软件对SMV-Am及其他已报道的100个SMV分离物进行核苷酸及氨基酸序列同源性分析；MEGA 7.0软件对用于系统进化分析；在线软件Network Protein Sequence(http://npsa-pbil.ibcp.fr)中的PROSCAN用于SMV-Am功能位点分析，I-TASSER和PyMOL用于分析SMV-Am的蛋白质结构变化；RDP4软件作为重组分析的工具。用于生物信息学分析的其他100条SMV分离物均来自于GenBank数据库。

2 结果

2.1 SIA检测

以感病白术叶片中提取出的dsRNA为模板，以M4T/M4为引物进行SIA检测。经凝胶电泳、测序和比对分析，得到大小为1 098 bp的非特异性片段(Fig.2)。将测序结果于NCBI数据库中进行Blast比对，最终发现该片段序列与SMV的相似性为84.5%-98.27%，并且与分离物SMV-pCB301-SC15(登录号：MH919386)的相似性最高，达到98.27%，因此，将该分离物命名为SMV-Am。

Fig.2 The dsRNAs were analyzed by the SIA method The degenerate primer M4，and the dsRNA，isolated from the susceptible Atractylodes macrocephala，were analyzed by the SIA method.M: DL 2 000TM DNA marker; Lanes 1-3: Infected plants; CK: Healthy plants

2.2 SMV-Am全基因组的扩增

以dsRNA逆转录所得cDNA为模板，首先用11对特异引物进行扩增，分别得到11个片段(Fig.3)，再以GSP和NGSP为引物进行RACE扩增并获得SMV-Am基因组末端序列(Fig.4)，所有相邻片段均无间隙，最终使用SeqMan软件对所得片段进行拼接，即获得全长为9 587 bp 的SMV-Am全基因组。

Fig.3 The specific fragments of SMV-Am were cloned by RT-PCR The specific primers，and the dsRNA，isolation from the susceptible Atractylodes macrocephala，were cloned by RT-PCR.(A)PCR product of SMV-F1422/SMV-R1422;(B)PCR product of SMV-F37-1 115/SMV-R37-1 115;(C)PCR product of SMV-F739-1 323/SMV-R739-1 323;(D)PCR product of SMV-F1298-2 785/SMV-R1298-2 785;(E)PCR product of SMV-F2538-3 991/SMV-R2538-3 991;(F)PCR product of SMV-F3802-5 293/SMV-R3802-5 293;(G)PCR product of SMV-F4524-5 650/SMV-R4524-5 650;(H)PCR product of SMV-F5628-6 145/SMV-R5628-6 145;(I)PCR product of SMV-F6080-7 707/SMV-R6080-7 707;(J)PCR product of SMV-F7404-8 643/SMV-R7404-8 643;(K)PCR product of SMV-F8540-9 273/SMV-R8540-9 273. M: DL 2 000TM DNA marker; Lanes 1-3: Infected plant; CK: Healthy plant

Fig.4 The RACE products of SMV-Am by the nested PCR method (A)5′-RACE amplification of SMV-Am genomic, PCR products using nest primers of SMV5′-GSP and SMV5′-NGSP;(B)3′-RACE amplification of SMV-Am genomic, PCR products using nest primers of SMV3′-GSP and SMV3′-NGSP.M: DL 2 000TM DNA marker; Lanes 1-3: Infected plant; CK: Healthy plant

对所得SMV-Am基因组进行分析，发现其具有典型的potyvirus基因组结构特征，编码一个大的多聚蛋白质，经自身编码的蛋白酶切割后，最终得到11个成熟的蛋白质。其中，P1、HC-Pro、P3、6K1、CI、6K2、NIa-VPg、NIa-Pro、NIb和CP蛋白之间的切割位点为Y/S、G/G、Q/A、Q/S、Q/S Q/G、E/S、Q/S、Q/S(Fig.5)，PIPO蛋白则是由移码突变产生。

Fig.5 Genome organizations of SMV-Am Y309/S: Amino acid cleavage sites between P1 and HC-Pro; G766/G: Amino acid cleavage sites between HC-Pro and P3; Q1 113/A: Amino acid cleavage sites between P3 and 6K1; Q1 165/G: Amino acid cleavage sites between 6K1 and CI; Q1 799/S: Amino acid cleavage sites between CI and 6K2; Q1 852/G: Amino acid cleavage sites between 6K2 and NIa-Vpg; E2 042/S: Amino acid cleavage sites between NIa-Vpg and NIa-Pro; Q2 285/S: Amino acid cleavage sites between NIa-Pro and NIb; Q2 802/S: Amino acid cleavage sites between NIb and CP

2.3 序列相似性分析

利用DNAMAN软件对SMV-Am与GenBank中已登录的100个SMV分离物进行序列相似性分析，结果如Talbe 3所示。SMV-Am与其他100个SMV分离物的核苷酸相似性为89.51%～96.57%，氨基酸相似性为94.10%～98.86%，且在这100个分离物中，与SMV-Am核苷酸和氨基酸序列相似性最高的分离物为SMV-Liaoning(GenBank登录号：MK350280.1)，分别为96.57%和98.86%，进一步证实感病白术为SMV侵染。

2.4 系统进化分析

利用MEGA 7.0软件完成SMV-Am与其他100条SMV序列的系统进化分析，采用邻接法(Neighbor-joining, NJ)以bootstrap = 1000构建系统进化树。结果正如Fig.6所示，SMV-Am与SMV-Liaoning分离株聚为一簇，亲缘关系最近。

2.5 功能位点突变及蛋白质结构分析

通过DNAMAN软件对SMV-Am和GenBank中100个SMV分离物的氨基酸序列比对后发现，P1、HC-Pro、P3、6K2、NIa-pro和NIb蛋白均发生了不同程度的氨基酸突变，经PROSCAN软件分析后发现，部分氨基酸突变发生在功能位点区域(Table 4)。例如：在P1蛋白中K35/T和V37/K 2个氨基酸的变化使蛋白激酶C磷酸化位点KQV变成TQK；HC-Pro蛋白中H65/N的变化使N-糖基化位点HLSW变化为NLSW；P3蛋白中L169/S的变化使蛋白激酶C磷酸化位点LEK变为SEK，等。其中，P1蛋白中在8个功能位点处检测到氨基酸突变，相较其他蛋白质最多。

根据PROSCAN分析结果，可得到SMV-Am中功能位点突变前后的氨基酸序列，之后利用I-TASSER软件对蛋白质进行三维结构模型预测。所得模型结果按照C值(C-score)评估，C值范围从-5到2，该分值越高，模型预测结果的置信度越高，因此选择各蛋白质C值最高的模型，利用三维结构分析软件PyMOL进行结构对比分析，结果正如Fig.7。

图中结果显示，6个蛋白质的整体空间构象均发生不同程度的变化。其中，P1蛋白存在7个氨基酸突变位点，三级结构变化最明显(Fig.7A)，NIb也有较为明显的三级结构变化(Fig.7F)，而HC-Pro、P3、6K2和NIa-Pro蛋白质的空间构象变化程度相对较小。并且在以上蛋白质中，P1蛋白的 K35/T、V37/K、A137/T、S140/T、K160/R、Y260/C突变位点，HC-Pro蛋白的H82/N突变位点，6K2蛋白的H3/Q突变位点，以及NIb蛋白中的S370/G和N460/S突变位点均引起了其所在功能区域二级结构的改变。

Fig.7 Effects of amino acid mutations at functional sites on protein structures (A)P1 protein; Red: Protein kinase C phosphorylation site; Green: N-myristoylation site including a Protein kinase C phosphorylation site; Blue: Protein kinase C phosphorylation site; Yellow: Protein kinase C phosphorylation site; Magenta: Protein kinase C phosphorylation site; Cyan: Casein kinase II phosphorylation site; Orange: Casein kinase II phosphorylation site.(B)Hc-pro protein; Red: N-glycosylation site; Green: N-myristoylation site.(C)P3 protein; Red: Protein kinase C phosphorylation site and Casein kinase II phosphorylation site.(D)6K2 protein; Red: Casein kinase II phosphorylation site.(E)NIa-pro protein; Red: N-glycosylation site.(F)NIb protein; Red: Casein kinase II phosphorylation site; Green: N-myristoylation site.Blue: Casein kinase II phosphorylation site

2.6 SMV-Am重组特征分析

利用RDP4软件对SMV-Am分离物以及NCBI中所得100个不同SMV分离物的全基因组进行重组分析。以RDP、GENENCONY、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan和3SEQ 7种方法进行分析，当存在有至少3种方法检测到P≤ 1.0×10-6时即认为存在重组事件的发生。结果表明，RDP、GENENCONY、BootScan、MaxChi、Chimaera、SiScan、3SEQ 7种方法均在SMV-Am基因组6 560～8 950 nt位置处检测到重组事件的发生(Table 5和Fig.8)，涉及到的蛋白质有NIa-Pro、NIb以及CP，并且RDP4的分析结果显示，SMV-Am的主要亲本为SMV-XFQ012分离物(GenBank登录号：KP710875.1)，次要亲本为SMV-pCB301-SC15分离物(GenBank登录号：MH919386.1)，两亲本均来自中国。

Table 4 Amino acid mutation analysis

Table 5 Recombination analysis of SMV-Am

Fig.8 Analysis of SMV-Am recombination based on RDP algorithm Blue line: identity of KP710875.1 and SMV-Am; Purple line: identity of MH919386.1 and SMV-Am; Yellow line: identity of KP710875.1 and MH919386.1; Red box: recombinant region

3 讨论

白术作为一种重要的药用植物，具有很高的经济价值，近年来日渐加重的白术病害严重影响着白术的产量与质量。本实验室之前在对山西省新绛县、河北省安国市的白术病毒病害调查中发现，白术的田间病株率可达90%以上，其中病毒病害植株皆表现花叶症状。通过对病样检测，发现侵染白术的病原为蚕豆萎蔫病毒2号和黄瓜花叶病毒，并分别命名为CMV-Am[15]和BBWV-2-Am[16]。除此之外，有关白术花叶病的报道十分有限。而本研究通过dsRNA提取以及SIA检测等方法，从河北省白术种植基地中的感病白术叶片中检测到SMV，并获得该分离物(SMV-Am)的全长基因组，经过序列比对分析以及系统进化分析发现，SMV-Am与SMV-Liaoning分离物亲缘关系最近。本研究是关于白术花叶症状病原的又一个报道，同时为白术病毒病的流行预防以及防控提供理论基础。

在长期的研究中，SMV的自然寄主范围很小，主要为大豆和豌豆等豆科植物，然而本研究报道了SMV的一种新寄主——白术。这可能是SMV在进化过程中发生了某种变异。基因组的突变和重组是病毒变异进化的重要因素。研究者们在对马铃薯Y病毒属病毒的长期研究中发现，该家族病毒基因组编码的HC-Pro[17-18]、P3[19]和CP[20]蛋白质与病毒寄主范围相关，而本文在对SMV-Am核苷酸与氨基酸序列分析后发现，该分离物除CP蛋白外，与寄主范围相关的蛋白质HC-Pro和P3均发生了不同程度的突变现象，而这一现象在另一个蛋白质——P1蛋白中表现的尤为明显；在以往的研究中发现，Potyvirus病毒的P1蛋白在不同病毒以及同一病毒不同株系之间均会出现较大的变异[21]，其作用是在病毒基因组翻译形成多聚蛋白质前体后，P1会特异性的识别和切割P1与HC-Pro之间的酶切位点，将多聚蛋白质进一步加工，最为重要的是，P1蛋白对HC-Pro发挥促进作用，能够提高HC-Pro的致病能力和沉默抑制作用[22]，那么SMV-Am可以侵染白术是否与P1和HC-Pro蛋白互作相关？还是P1蛋白本身的突变在一定程度上也直接影响到SMV-Am寄主范围的变化？Shan等[23]发现，A型P1蛋白的缺失突变会使李痘病毒(plum pox virus, PPV)的寄主发生变化。除了关键蛋白质的突变外，重组也是造成病毒能够适应新寄主的重要原因[24-27]，Yang等[28,29]对SMV-SC7株系的研究发现，该株系由SMV和菜豆普通花叶病毒(bean common mosaic virus, BCMV)之间发生重组产生的，且属于强毒株，可以侵染非自然寄主烟草。本研究利用RDP4软件对SMV-Am基因组进行了重组分析，发现在其6 560～8 950 nt区域内存在重组事件，主要亲本和次要亲本分别为SMV-XFQ012和SMV-pCB301-SC15，重组的发生也可能是SMV能侵染白术的原因。然而，对于病毒侵染的具体机制，需要进一步构建侵染性克隆并进行相关试验才有望解答，而本研究为SMV的致病机制研究提供了新的切入点和科学依据。