lncRNA TUG1对人牙髓干细胞成骨/成牙本质分化的影响

人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）源自于迁移的神经嵴细胞，于2000 年首次从人牙髓中分离和鉴定，具有高度增殖、自我更新和多向分化等间充质干细胞的特性

。其取材方便、易于扩增保存、活性高，能在特定条件下分化为多种组织细胞，是干细胞治疗中极有潜力的细胞来源

，在再生医学领域中具有广阔的应用前景。牛磺酸上调基因1（taurine upregulated 1，TUG1）是一种长链非编码RNA，位于第22 号染色体上，最早由学者Young 等

从小鼠视网膜细胞中发现，被认为是视网膜细胞发育和光感受器形成的重要参与者。有学者发现TUG1 可促进骨髓间充质干细胞

以及牙周膜细胞

成骨向分化。但TUG1在hDPSCs的增殖及成骨/成牙本质向分化过程中的表达水平和功能作用尚未见报道。本研究旨在通过感染慢病毒构建沉默TUG1 的hDPSCs，探究TUG1对hDPSCs 的增殖及成骨/成牙本质分化的影响。

1 材料和方法

1.1 主要材料和仪器

α-MEM 培养基（Procell，中国），青霉素-链霉素、胰酶细胞消化液、碱性磷酸酶（alkaline phospha-tase，ALP）显色试剂盒（Beyotime，中国），胎牛血清（vivacell，意大利），地塞米松、维生素C、茜素红染色液（Solarbio，中国），β-甘油磷酸钠（Macklin，中国），Ⅰ型胶原酶（Biofroxx，德国），CD44、CD45、CD73、CD90、CD133、STRO-1 抗体（Ebioscience，美国），甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase，GAPDH）抗体（Abcam，英国），兔抗人DPSS 抗体（Abcam，英国），兔抗人DMP-1抗体（Abcam，英国），兔抗人Runx2 抗体（Abcam，英国），兔抗人OCN 抗体（Abcam，英国），兔抗人OPN抗体（Abcam，英国），山羊抗兔二抗（Proteintech，美国），4%多聚甲醛（Biosharp，中国），CCK-8 试剂盒（Dojindo，日本），氯化十六烷吡啶（Sloarbio，中国），BCA 蛋白浓度测定试剂盒（Beyotime，中国），ALP测定试剂盒（南京建成，中国），SteadyPure 快速RNA 提取试剂盒、Evo M-MLV 反转录预混型试剂盒、SYBR Green Pro Taq HS 预 混 型qPCR 试 剂 盒（Accurate，中国）。

1.2 hDPSCs 的分离培养和鉴定

本研究已取得西南医科大学附属口腔医院伦理委员会批准（批号：20220531002）。牙髓组织来源于西南医科大学附属口腔医院颌面外科，采用酶消化组织块法提取hDPSCs。患者及家属知情同意后，拔除因正畸要求拔除的前磨牙，于无菌条件下劈开牙齿，取出牙髓，立即用含青霉素-链霉素的PBS 梯度冲洗，剪碎牙髓组织，加入Ⅰ型胶原酶（3 g/L），15 min 后加入完全培养基，低速离心后弃上清液，将消化后的组织块接种于培养瓶底后倒置培养瓶，加入完全培养基，于37 ℃、体积分数5% CO

条件下培养，4 h 组织块贴壁后翻转培养瓶，每隔3 d 换液，细胞长至瓶底80%后传代。取第3 代hDPSCs 流式细胞仪检测表面标志物CD44、CD45、CD73、CD90、CD133、STRO-1。取 第3 代hDPSCs 于6 孔板，成骨诱导7 d 进行ALP 染色，成骨诱导21 d 进行茜素红染色观察。

1.3 qRT-PCR 检测hDPSCs 中TUG1 的表达

取第3 代hDPSCs 于6 孔板，分别于成骨诱导0、7、14 d 提取细胞总RNA，测得RNA 浓度，逆转录获得cDNA，实时定量扩增，检测成骨过程中TUG1的表达变化，实验重复3 次。

1.4 慢病毒转染

慢病毒sh- TUG1 载体pSLenti-U6-shRNA（TUG1）-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE 由上海和元技术股份有限公司提供，sh-TUG1 序列为：5′-GCTTGGCTTCTATTCTGAATCCTTT-3′；取第3 代的hDPSCs 接种至6 孔板中，待细胞长至50%时进行转染，根据转染说明书，慢病毒滴度为3.78×10

TU/mL，通过转染预实验测定其感染复数为40；加入5 mg/L 聚凝胺提高转染效率，12 h 后换完全培养基继续培养。48 h 后使用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白的表达，确认感染成功后加入4 mg/L嘌呤霉素筛选稳定转染株。根据病毒转染情况将细胞分为3 组：①空白对照组（NC 组）：未转染处理的hDPSCs；②阴性对照组（sh-NC 组）：感染无序列质粒载体慢病毒的hDPSCs；③实验组（sh-TUG1组）：感染sh-TUG1 慢病毒的hDPSCs。

1.5 CCK-8 检测细胞增殖活性

按试剂盒步骤分别提取成骨诱导7 d 时3 组细胞总RNA，测得RNA 浓度，去除基因组DNA，逆转录获得cDNA，实时定量扩增，检测成牙本质及成骨分化相关的基因牙本质涎磷蛋白（dentin sialoph-osphoprotein，DSPP），牙本质基质蛋白-1（dentine matrix protein 1，DMP-1），Runt 相关转录因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2），骨钙素（osteo-calcin，OCN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）的基因表达，实验重复3 次。目的基因的相对表达量使用2

方法计算得出。引物序列见表1。

式中：Q为加热器加热功率，W；M1为热箱外壁热流系数，W/K；M2为试件框热流系数，W/K；Δθ1为热箱外壁内外表面面积加权温度平均温度之差，K；Δθ2为试件框热侧冷测表面面积加权平均温度之差，K；S1为填充用绝热板的面积，m2；Δ1为填充用绝热板的热导率,W/(m2·K)；Δθ3为填充用绝热板表面的平均温差，K；A为试件面积，m2；Δt为热箱与冷箱空气平均温度之差，K.

1.6 ALP 染色及定量检测

MRI的T2像虽较CT敏感，但在LA的早期单纯依靠肉眼观察尚无法分辨出明显信号改变，近年来新的磁共振成像技术开始用于LA的早期诊断。

将NC 组、sh-NC 组和sh-TUG1 组细胞分别接种于6 孔板中，待细胞贴壁后更换为成骨诱导培养基。成骨诱导7 d，按ALP 显色试剂说明书配置染液，染色15 min，在倒置显微镜下观察。将成骨诱导7 d 的细胞裂解，BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定总蛋白质浓度，ALP 定量试剂盒检测样本内细胞ALP 活性，实验重复3 次。

1.7 茜素红染色及定量检测

hDPSCs 具有多向分化潜能，可以在特定条件下分化为牙本质

、牙周组织

、骨

、神经组织

和皮肤组织

等多种组织细胞，可用于牙本质及骨组织再生等研究领域，目前已成为组织再生与工程领域的研究热点。

1.8 qRT-PCR 检测成牙本质及成骨分化相关基因mRNA 水平

将NC 组、sh-NC 组和sh-TUG1 组细胞分别接种于96 孔板，每孔2×10

个。在1、3、5、7 d 进行CCK-8检测。去除原培养基，添加CCK-8 混合工作液，在避光条件下孵育1 h，酶标仪在450 nm 处测定吸光度值，实验重复3 次。

基于灵敏度分析的参数模型修正基本思路是通过构造理论模型与实际结构之间在相同条件下动态特性的误差，然后选择修正参数进行修正，以尽量缩小理论模型与实际结构之间的误差为目的，最终获得一个较为精确的有限元模型。要实现此目标，首先初始模型需要建立得尽量准确，避免结构上的误差；其次要设法提高试验数据的精度；同时要开发稳定高效的修正算法。目前，使用较多的算法是二次规划优化算法，其在仿真算例的应用中，收敛速度快、修正效率高、修正结果准确可信。但在解决工程实际问题时，由于目标函数的构建问题，无法得到一个较为准确的有限元模型。

1.9 Western blot 检测hDPSCs 成牙本质及成骨分化相关蛋白含量

成骨诱导培养7 d，ALP 染色及定量检测结果显示sh-TUG1 组着色较NC 组（

= 0.002）和sh-NC组（

= 0.006）浅，而NC 组和sh-NC 组间无明显差异（图5），说明沉默TUG1 后hDPSCs 早期ALP 活性减弱。

1.10 统计学分析

hDPSCs 成骨诱导0、7、14 d，分别收集细胞提取总RNA 进行qRT-PCR 检测TUG1 含量相对变化，结果显示，TUG1 的含量在成骨诱导过程中逐渐增加，相较于0 d，成骨诱导7 d（

= 0.001）、14 d（

＜0.001）时，TUG1 mRNA 表达明显升高，差异有统计学意义（图2）。

2 结 果

2.1 hDPSCs 的分离培养和鉴定

组织块培养5～7 d 后显微镜下可见细胞沿组织块边缘爬出（图1a），呈放射状生长；传至第3 代时观察细胞呈长梭形，胞核明显，呈旋涡状生长（图1b）。流式细胞术检测细胞高表达间充质来源的表面标志物CD44、CD73、CD90、CD133、STRO-1，低表达造血组织来源的表面标志物CD45（图1c）。ALP 和茜素红染色显示成骨诱导后的ALP 活性强（图1d）且具有矿化结节生成能力（图1e）。

2.2 TUG1 在hDPSCs 成骨分化过程中上调

用SPSS 19.0分析数据，计量资料的组间比较采用单因素方差分析，

＜0.05为差异有统计学意义。

1.2 病例诊断及监测 80年代开始，对临床诊断为疟疾、疑似疟疾、疑似感冒及其他原因不明的发热病人（称“四热病人”）采血涂片镜检［2］，以血检疟原虫阳性者统计发病率。2006年以后诊断依据根据中华人民共和国卫生行业标准之疟疾诊断标准（WS259-2006）。

3)白城站20种天气模态下逐日降水量预测模型的MAE为0.08～7.94 mm,RMSE为0.25～11.86 mm。降水量越大,模型的MAE和RMSE也越大。在第4类最不容易发生降水的天气模态下,MAE和RMSE都不超过1 mm。在第1类最容易发生降水的天气模态下,最大逐日降水量都超过60 mm,MAE为7～8 mm,RMSE为11～12 mm。

2.3 构建沉默TUG1 的hDPSCs

荧光显微镜观察慢病毒感染hDPSCs 48 h 后，细胞表达绿色荧光（图3a、3b），表明慢病毒成功感染hDPSCs，qRT-PCR 证实感染慢病毒后TUG1 沉默效率高于60%（

＜0.001）（图3c）。

2.4 沉默TUG1 抑制hDPSCs 的增殖

通过CCK-8 法检测细胞的增殖能力（图4），与NC 组相比，sh-NC 组hDPSCs 的增殖能力未发生明显变化（

＞0.05），在5 d（

= 0.001 0）、7 d（

=0.001 1）、9 d（

= 0.004 0）时，sh-TUG1 组hDPSCs的增殖能力减弱（

＜0.05）。

2.5 沉默TUG1 后抑制hDPSCs 的ALP 活性及矿化结节的形成

在成骨诱导7 d 时，提取3 组细胞蛋白并测定其浓度，SDS- PAGE 凝胶电泳，转膜90 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，加一抗，（DSPP，1∶500；DMP-1，1∶1 000；RUNX2，1∶2 000；OCN，1∶1 000；OPN，1∶1 000；GAPDH，1∶10 000），4 ℃振荡过夜。TBST 润洗3 遍后加入二抗（1∶10 000），37 ℃孵育1 h，显影成像，Image J（National Institute of Mental Health，美国）软件分析结果，实验重复3 次。

成骨诱导培养21 d，茜素红染色及定量检测结果显示NC 组（

= 0.005）和sh-NC 组（

= 0.005）矿化结节形成能力明显高于sh-TUG1 组，而NC 组和sh-NC 组间无明显差异（图6）。说明沉默TUG1 后hDPSCs 晚期矿化结节形成能力减弱。

2.6 沉默TUG1 后hDPSCs 成骨/成牙本质相关基因和蛋白表达水平下调

成骨诱导7 d，qRT-PCR 和Western blot 技术检测各组细胞中成牙本质分化相关基因（DSPP、DMP-1）以及成骨分化相关基因（Runx2、OCN、OPN）的mRNA 和蛋白含量变化（图7），和NC 组相比，sh-NC 组细胞内成牙本质及成骨分化相关基因的mRNA 和蛋白含量未发生明显变化（

＞0.05）；相较NC 组和sh-NC 组，sh-TUG1 组成牙本质及成骨分化相关基因的mRNA 和蛋白表达降低（

＜0.05）。

3 讨 论

将NC 组、sh-NC 组和sh-TUG1 组细胞分别接种于6 孔板中，待细胞贴壁后更换为成骨诱导培养基。成骨诱导21 d，用0.2%茜素红染液染色30 min，倒置显微镜下观察。超纯水清洗3 次，加入氯化十六烷基吡啶溶液，避光30 min，将上清液置于96 孔板中，酶标仪在562 nm 处测定吸光度值，实验重复3 次。

lncRNA 是一类长度超过200 bp、不编码蛋白质的RNA

。近年来，高通量测序技术的进步提高了对细胞中lncRNA 及其复杂信号网络的认识。lncRNA 可参与多种生物学过程，如染色质调控和基因表达

。在胚胎干细胞中lncRNA 具有调节细胞周期、维持细胞的多向分化潜能的作用，也可能参与细胞的更新和分化

。此外，大量研究已证明lncRNA 在间充质干细胞骨形成调控中的不同作用，例如，lncRNA XIXT 通过miRNA-30a-5p 上调RUNX2，从而诱导hBMSCs 成骨缓解骨质疏松。lncRNA HOTAIRM1 通过调节JNK/AP-1 信号介导的RUNX2 表达来促进成骨分化

。

TUG1 是一个7.1 kb 的lncRNA，首次在发育中的小鼠视网膜细胞中发现，对牛磺酸处理反应上调

。研究发现TUG1 在人类多种癌症中表达上调，促进癌细胞增殖、迁移和侵袭，抑制细胞凋亡，是一个新发现的致癌基因。近年来研究发现沉默TUG1 会显著抑制主动脉瓣钙化疾病下破骨细胞的形成，且TUG1 通过miR-204-5p 上调RUNX2 基因表达，促进主动脉瓣钙化疾病中的成骨细胞分化

。Teng 等

发现TUG1 在骨质疏松症中下调，影响骨髓间充质干细胞的成骨分化。Lu 等

进一步研究发现TUG1 通过调控AMPK/mTOR/自噬通路促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。Hao 等

发现TUG1 促进了成骨前体细胞的增殖，且通过miR-545-3p 上调CNR2 促进成骨前体细胞的成骨分化。Liu 等

发现沉默TUG1 后成骨经典通路Wnt/β-catenin 通路重要标志物Runx2、Frizzled-2、Axin2和β-catenin 表达下调。以上这些研究表明TUG1在干细胞成骨分化过程中起着重要作用。但TUG1 在hDPSCs 成骨/成牙本质向分化过程中的表达水平和作用尚未见报道。

本研究成功分离并鉴定hDPSCs，发现TUG1 在hDPSCs 成骨分化中明显增加。为验证TUG1 对hDPSCs 增殖和成骨/成牙本质分化的调控作用，利用慢病毒感染技术体外成功构建沉默TUG1 的hDPSCs。发现沉默TUG1 后hDPSCs 增殖被抑制。通过ALP 和茜素红染色及定量检测发现在成骨诱导条件下，沉默TUG1 抑制hDPSCs 的早期ALP 活性和晚期矿化结节形成能力。通过qRT-PCR 检测验证了TUG1 抑制hDPSCs 内DSPP、DMP-1、Runx2、OCN 和OPN 等基因的表达。DSPP 是牙本质中最丰富的非胶原蛋白

，DMP-1 为成牙本质细胞分化早期的标志

，均在牙本质的形成及矿化中起到重 要 作 用。Runx2 是 成 骨 分 化 早 期 标 志

。Sheng 等

发现lncRNA TUG1 通过RUNX2 促进骨肉瘤的发展，Du 等

发现沉默lncRNA TUG1 通过Runx2/ANPEP 增强氧化低密度脂蛋白处理的人脐静脉内皮细胞的增殖和迁移，促进动脉粥样硬化血管损伤的修复。OPN 和OCN 分别是成骨分化中晚期和晚期的标志

。Teng 等

发现与健康对照组相比，骨质疏松患者血浆中TUG1 表达明显降低，miR-23b 表达明显增加。此外，miR-23b 表达增加可抑制RUNX2、骨钙素和骨桥蛋白的表达。在本实验中发现沉默TUG1 抑制了hDPSCs 向成牙本质细胞及成骨细胞的分化。

2.2 中耕除草 应根据豆苗生育状况及田间杂草多少而定进行2～3次中耕。第一次中耕以第一片真叶出现时为宜，中耕深度不宜超过3.5厘米；第二次中耕可在出现3～4片复叶，子叶发黄时进行，深度为4.5厘米；第三次中耕一般在苗高20厘米左右时，开花前进行，宜浅耕，并结全培土，培土高度以略高于子叶节为准。

本实验探讨了TUG1 在hDPSCs 成骨过程中的表达水平以及对增殖和成骨/成牙本质分化的影响，但TUG1 对hDPSCs 增殖和分化的调控机制及体内实验仍有待进一步研究。

绘本，顾名思义就是“画出来的书”，也就是指图文相互有机结合的书籍。现在市面上的绘本图书以儿童阅读为主，内容涉及也很广，文学、科学、教育等等。近年来，市场上出现了成人绘本，以台湾绘本家几米的最为火热，还有钱海燕、寂地等都是以成人绘本创作为主的。这些成人绘本中有很大一部分属于治愈系绘本。

【

】 Jiang YX performed the experiments and wrote the article. Sun LH collected the data. Zhang H assisted in the da-ta statistics. Li ST assisted in the experimental design. Feng H designed the experiments and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

[1] Gronthos S, Mankani M, Brahim J, et al. Postnatal human dental pulp stem cells(DPSCs)

and

[J].Proc Natl Acad Sci USA,2000,97(25):13625-13630.doi:10.1073/pnas.240309797.

[2] Sui B, Wu D, Xiang L, et al. Dental pulp stem cells: from discov-ery to clinical application[J].J Endod, 2020,46(9S):S46-S55.doi:10.1016/j.joen.2020.06.027.

[3] Young TL,Matsuda T,Cepko CL.The noncoding RNA taurine up-regulated gene 1 is required for differentiation of the murine retina[J]. Curr Biol, 2005, 15(6): 501-512. doi: 10.1016/j.cub.2005.02.027.

[4] Lu DG, Lu MJ, Yao SH, et al. Long non-coding RNA TUG1 pro-motes the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells by regulating the AMPK/mTOR/autophagy pathway[J].Biomed Res, 2021, 42(6): 239-246. doi: 10.2220/biomedres.42.239.

[5] He Q,Yang S,Gu X,et al.Long noncoding RNA TUG1 facilitates osteogenic differentiation of periodontal ligament stem cells via in-teracting with Lin28A[J]. Cell Death Dis, 2018, 9(5): 455. doi:10.1038/s41419-018-0484-2.

[6] Lin CY,Tsai MS,Kuo PJ,et al.2,3,5,4'-Tetrahydroxystilbene-2-O-β-d-glucoside promotes the effects of dental pulp stem cells on rebuilding periodontal tissues in experimental periodontal defects[J]. J Periodontol, 2021, 92(2): 306-316. doi: 10.1002/JPER.19-0563.

[7] Wu Y, Lian K, Sun C. LncRNA LEF1-AS1 promotes osteogenic differentiation of dental pulp stem cells via sponging miR-24-3p[J]. Mol Cell Biochem, 2020, 475(1/2): 161-169. doi: 10.1007/s11010-020-03868-7.

[8] Mortada I, Mortada R, Al Bazzal M. Dental pulp stem cells and neurogenesis[J]. Adv Exp Med Biol, 2018, 1083: 63-75. doi:10.1007/5584_2017_71.

[9] Nishino Y, Ebisawa K, Yamada Y, et al. Human deciduous teeth dental pulp cells with basic fibroblast growth factor enhance wound healing of skin defect[J].J Craniofac Surg,2011,22(2):438-442.doi:10.1097/SCS.0b013e318207b507.

[10] Chi Y,Wang D,Wang J,et al.Long non-coding RNA in the patho-genesis of cancers[J]. Cells, 2019, 8(9): 1015. doi: 10.3390/cells8091015.

[11] Bridges MC, Daulagala AC, Kourtidis A. LNCcation: lncRNA lo-calization and function[J]. J Cell Biol, 2021, 220(2): e202009045.doi:10.1083/jcb.202009045.

[12] Aich M, Chakraborty D. Role of lncRNAs in stem cell mainte-nance and differentiation[J]. Curr Top Dev Biol, 2020, 138: 73-112.doi:10.1016/bs.ctdb.2019.11.003.

[13] Ju C, Liu R, Zhang YW, et al. Mesenchymal stem cell-associated lncRNA in osteogenic differentiation[J]. Biomed Pharmacother,2019,115:108912.doi:10.1016/j.biopha.2019.108912.

[14] Zhang HL,Du XY,Dong QR.LncRNA XIXT promotes osteogenic differentiation of bone mesenchymal stem cells and alleviates os-teoporosis progression by targeting miRNA-30a-5p[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2019, 23(20): 8721-8729. doi: 10.26355/eur-rev_201910_19266.

[15] Fu L, Peng S, Wu W, et al. LncRNA HOTAIRM1 promotes osteo-genesis by controlling JNK/AP-1 signalling-mediated RUNX2 ex-pression[J]. J Cell Mol Med, 2019, 23(11): 7517 - 7524. doi:10.1111/jcmm.14620.

[16] Yu C, Li L, Xie F, et al. LncRNA TUG1 sponges miR-204-5p to promote osteoblast differentiation through upregulating Runx2 in aortic valve calcification[J]. Cardiovasc Res, 2018, 114(1): 168-179.doi:10.1093/cvr/cvx180.

[17] Teng Z,Zhu Y,Hao Q,et al.Long non-coding RNA taurine upreg-ulated gene 1 is downregulated in osteoporosis and influences the osteogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells[J].Peer J,2021,9:e11251.doi:10.7717/peerj.11251.

[18] Hao R,Wang B,Wang H,et al.lncRNA TUG1 promotes prolifera-tion and differentiation of osteoblasts by regulating the miR-545-3p/CNR2 axis[J]. Braz J Med Biol Res, 2020, 53(11): e9798. doi:10.1590/1414-431X20209798.

[19] Liu SC, Sun QZ, Qiao XF, et al. LncRNA TUG1 influences osteo-blast proliferation and differentiation through the Wnt/β-catenin signaling pathway[J]. Eur Rev Med Pharmacol Sci, 2019, 23(11):4584-4590.doi:10.26355/eurrev_201906_18035.

[20] Yamakoshi Y. Dentin sialophophoprotein (DSPP) and dentin[J]. J Oral Biosci,2008,50(1):33-44.doi:10.2330/joralbiosci.50.33.

[21] Toyosawa S, Okabayashi K, Komori T, et al. mRNA expression and protein localization of dentin matrix protein 1 during dental root formation[J]. Bone, 2004, 34(1): 124-133. doi: 10.1016/j.bone.2003.08.010.

[22] Vimalraj S. Alkaline phosphatase: structure, expression and its function in bone mineralization[J]. Gene, 2020, 754: 144855. doi:10.1016/j.gene.2020.144855.

[23] Komori T.Regulation of proliferation,differentiation and functions of osteoblasts by Runx2[J]. Int J Mol Sci, 2019, 20(7): 1694. doi:10.3390/ijms20071694.

[24] Sheng K,Li Y.LncRNA TUG1 promotes the development of osteo-sarcoma through RUNX2[J]. Exp Ther Med, 2019, 18(4): 3002-3008.doi:10.3892/etm.2019.7880.

[25] Du H,Yang L,Zhang H,et al.LncRNA TUG1 silencing enhances proliferation and migration of ox-LDL-treated human umbilical vein endothelial cells and promotes atherosclerotic vascular injury repairing via the Runx2/ANPEP axis[J]. Int J Cardiol, 2021, 338:204-214.doi:10.1016/j.ijcard.

[26] Komori T. Functions of osteocalcin in bone, pancreas, testis, and muscle[J]. Int J Mol Sci, 2020, 21(20): 7513. doi: 10.3390/ijms21207513.

[27] Si J,Wang C,Zhang D,et al.Osteopontin in bone metabolism and bone diseases[J]. Med Sci Monit, 2020, 26: e919159. doi: 10.12659/MSM.919159.