超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱质谱法快速鉴定柴胡化学成分

刘月程，田振华

(1.山东省中医药研究院，济南 250014； 2.山东中医药大学，实验中心，济南 250355)

柴胡始载于《神农本草经》，是我国常用中药材，具有和解表里、疏肝、升阳等功效，其性微寒、味苦[1]。《中国药典》2020 年版将伞形科植物柴胡(又称北柴胡)或狭叶柴胡(又称南柴胡)收录为正品柴胡入药。现代研究表明，柴胡主要含皂苷、有机酸、黄酮、挥发油及甾醇类，柴胡皂苷为柴胡的主要有效成分。郭敏娜等[2]利用高效液相色谱-四级杆-飞行时间串联质谱联用技术(HPLC-Q-TOF-MS)鉴定了柴胡中的21 种化合物。杨印军等[3]利用UPLC-Q-TOF-MS 分析、比较了北柴胡、竹叶柴胡、藏柴胡和小叶黑柴胡化学成分。邢威等[4]应用UPLC-Q-TOF-MS 法分析了柴胡-白芍药对化学成分。超高效液相色谱-四级杆静电场轨道阱质谱(UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS)具有灵敏度高、分辨率高、分离度高等优点，能够准确的鉴定药材化学成分。前述研究对柴胡的化学成分进行了初步分析，但确认的成分数量相对较少。笔者采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 对柴胡进行分析，并推导出其中化合物的质谱裂解规律，为柴胡的成分表征和质量控制研究提供参考。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱质谱仪：Thermo Fisher Ultimate 3000 型及Q Exactive 型，Xcalibur 3.0 工作站，美国赛默飞世尔科技公司。

数控超声清洗器：KQ-250E 型，昆山市超声仪器有限公司。

电子天平：CP225D 型，感量为0.01 mg，德国赛多利斯公司。

粉碎机：DFY-1000C 型，温岭市林大机械有限公司。

绿原酸、阿魏酸、异鼠李素、芹菜素对照品：纯度均不小于98%，批号分别为PS2049-0100MG、PS0258-0050MG、PS0845-0020MG、PS1300-0100MG，成都普思生物科技股份有限公司。

甲醇：色谱纯，国药集团化学试剂有限公司。乙腈、甲酸：色谱纯，美国赛默飞世尔科技公司。

柴胡药材样品：批号为2112300202，产地为山西，亳州市沪谯药业有限公司提供，经山东中医药大学实验中心刘红燕副教授鉴定为伞形科柴胡属(Bupleuri Radix)的根。

实验用水：蒸馏水，广州屈臣氏食品饮料有限公司。

1.2 溶液制备

1.2.1 柴胡样品溶液

取柴胡药材粉末约10 g，精密称定，置于具塞三角瓶中，精密加入甲醇100 mL，以40 kHz 超声20 min，放凉，用甲醇补足损失的质量，过滤，取续滤液，用0.22 μm 微孔滤膜过滤，得柴胡样品溶液。

1.2.2 对照品溶液

精密称取绿原酸、阿魏酸、异鼠李素、芹菜素对照品适量，用甲醇溶解、定容，制得质量浓度均为0.10 mg/mL 的单对照品溶液。

1.3 仪器工作条件

1.3.1 色谱仪

色 谱 柱：ACQUITY UPLC®HSS T3 柱[100 mm×2.1 mm，1.8 μm，沃特世科技(上海)有限公司]；流动相：0.05%甲酸水溶液(A)-0.05%甲酸乙腈溶液(B)，流量为0.3 mL/min，梯度洗脱；梯度洗脱程序：0～5 min 为0% B，5～40 min 为0%～100%B；柱温：30 ℃；进样体积：3 μL。

1.3.2 质谱仪

电喷雾离子源(ESI)；正、负离子模式扫描；鞘气流量：13.5 L/min；辅助气流量：3 L/min；喷雾电压：3.5 kV(+)，3.0 kV(-)；毛细管温度：350 ℃；辅助器加热温度：350 ℃；S-lens RF level：55；扫描模式：Full MS/dd-MS2(Full MS 分辨率为70 000，dd-MS2分辨率为17 500)；扫描范围：80～1 200 Da；碰撞能：20、40、60 eV。

1.4 化合物结构鉴定

按照1.3 仪器工作条件分析后，用Thermo Xcalibar 4.3 软件的Qual Browser 模块计算出精确质量数，根据实际测得的相对分子质量与理论相对分子质量二者偏差小于5 ×10-6的原则[5]及同位素丰度比、氮规律，用Qual Browser 软件拟合分子式，通过二级碎片离子推测化合物结构，再依据对照品和相关参考文献及碎片离子信息进一步推断待测化学成分结构，最后以美国赛默飞世尔科技有限公司的Mass Frontier 7.0 软件的碎片离子匹配(Fragments and Mechanisms)功能对化合物进行验证。部分同分异构体采用ChemDraw 18.0 软件(美国CambridgeSoft 公司)的ClogP值判断极性大小，结合文献推测保留时间先后，从而进行有效区分[5]。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

2.1.1 样品处理

分别选择50%甲醇-水、70%甲醇-水、甲醇作为提取溶剂超声提取样品。通过对样品质谱数据的提取，发现与水、70%甲醇-水相比，甲醇提取样品的总离子流图中有效成分峰更多，响应值较高。因此选择甲醇作为提取溶剂。

2.1.2 洗脱溶剂与洗脱梯度

为促进化学成分的电离，需在流动相中加入适量甲酸，从而有助于提高离子响应值[6]。分别选择0.05%、0.1%、0.2%甲酸溶液作为溶剂，考察溶剂对实验结果的影响。结果表明，以上比例甲酸溶液对色谱峰形与响应值没有显著影响，最终选择0.05%甲酸溶液作为基础流动相，流动相A 为0.05%甲酸水溶液，B 为0.05%甲酸乙腈溶液，分别选择洗脱梯度为0～35 min、0%～100% B；35～40 min、100%B 进行试验，根据总离子流图，发现在某些时间段内色谱峰分离度较差，则适当延长此段时间；在某些时间段内出峰数量较少，则适当缩短此段时间。最终优化的流动相洗脱梯度见1.3.1。

2.1.3 碰撞能

将碰撞能逐级分别设定为10、25、40 eV 和30、50、70 eV。根据获取的质谱数据，发现低碰撞能时碎片离子信息较少，故需要提高碰撞能；高碰撞能时分子离子峰强度减弱或几乎没有分子离子峰，需要降低碰撞能。最终确定碰撞能为20、40、60 eV。

2.2 柴胡化学成分鉴定结果

采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 对柴胡甲醇提取物的化学成分进行分析，得到正、负离子模式下柴胡样品的总离子流色谱图如图1，对照品溶液的总离子流图如图2～图5。根据1.4 数据分析方法，共鉴定出65 种化学成分，其中皂苷类32 种，黄酮类11 种，酸类18 种，其它类4 种，具体结果见表1。

表1 UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 鉴定的柴胡中化学成分

续表1

图1 柴胡样品UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 总离子流图

图2 绿原酸对照品总离子流图

图3 阿魏酸对照品总离子流图

图4 异鼠李素对照品总离子流图

图5 芹菜素对照品总离子流图

2.3 化合物质谱解析

2.3.1 皂苷类化合物的鉴定

皂苷类成分是柴胡中的主要功效成分，皂苷类化合物含糖，易丢失母核上连接的葡萄糖或葡萄糖残基、海藻糖基、H2O、CO2等中性碎片[7]。化合物30 在ESI-模式总离子流图下得到m/z925.515 50 [M-H]-，拟合分子式为C48H78O17，脱去一个海藻糖基(Fuc，146 Da)，得到m/z779.457 89[M-H-Fuc]-，脱去一个葡萄糖基(Glu，162 Da)，得到m/z617.405 33 [M-H-Fuc-Glu]-。m/z971.522 03[M+COOH]-为该化合物结合一个羧基。根据文献[8]报道，符合柴胡皂苷c 的裂解规律，与Mass Frontier 中匹配二级碎片离子一致，鉴定其为柴胡皂苷c。化合物33 在ESI-模式总离子流图下得到m/z927.526 00 [M-H]-，拟合分子式为C48H80O17，脱去一个葡萄糖基，得到m/z765.480 04 [M-H-Glu]-，接着脱去一个海藻糖基，得到m/z619.421 94[M-H-Glu-Fuc]-。根据文献[3]、[16]报道，符合柴胡皂苷f 的裂解规律，与Mass Frontier 中匹配二级碎片离子一致，鉴定其为柴胡皂苷f，柴胡皂苷f 可能的裂解途径及相应的二级质谱图见图6，具体信息见表1。化合物36、39、45、53 在ESI-模式总离子流图下均得到m/z779 [M-H]-的分子离子峰，拟合分子式为C42H68O13，脱去一个葡萄糖，得到m/z617[M-H-Glu]-，再脱去一个海藻糖基，得到m/z471[M-H-Glu-Fuc]-。m/z825 [M+COOH]-为该化合物结合一个羧基，根据文献[2]、[3]报道，符合柴胡皂苷a 或同分异构体的裂解规律，与Mass Frontier 中匹配二级碎片离子一致，鉴定其为柴胡皂苷a 或同分异构体。同时根据四者ClogP值比较，柴胡皂苷g 的ClogP值最高，因此化合物53 为柴胡皂苷g，柴胡皂苷a、柴胡皂苷d 的ClogP值相同，同时结合文献[2]、[3]、[16]、[18]报道，化合物36 为柴胡皂苷a，化合物39 为柴胡皂苷b2，化合物45 为柴胡皂苷d。柴胡皂苷a 可能的裂解途径及相应的二级质谱图见图7，具体信息见表1。

图6 负离子模式下柴胡皂苷f 可能的裂解途径及二级质谱图

图7 负离子模式下柴胡皂苷a 可能的裂解途径及二级质谱图

2.3.2 黄酮类化合物的鉴定

黄酮类化合物的质谱特征较强，多发生逆狄尔斯-阿德尔反应(RDA)，经能量碰撞会失去H2O、CO2、CO、CHO 等一系列中性小分子[10]，易产生甲基、羧基、糖苷等碎片离子。以化合物14 为例，在ESI+模式总离子流图下得到m/z611.159 73[M+H]+，拟合分子式为C27H30O16，脱去一个鼠李糖基(Rha，146 Da)，得到m/z465.102 45 [M+H-Rha]+，接着脱去一个葡萄糖基，得到m/z303.049 07[M+H-Rha-Glu]+，根据文献[5]报道，符合芦丁的裂解规律，与Mass Frontier 中匹配二级碎片离子一致，鉴定其为芦丁，芦丁可能的裂解途径及相应的二级质谱图见图8，具体信息见表1。化合物19 在ESI-模式总离子流图下得到m/z447.093 72 [M-H]-的分子离子峰，拟合分子式为C21H20O11，脱去一分子鼠李糖基，得到m/z301.035 10 [M-H-Rha]-，接着失去一个氢，得到m/z300.028 08 [M-H-Rha-H]-。根据文献[14]报道，符合槲皮苷的裂解规律，与Mass Frontier 中匹配二级碎片离子一致，鉴定其为槲皮苷。化合物25 在ESI+模式总离子流图下得到m/z303.049 29 [M+H]+，拟合分子式为C15H10O7，脱去一分子水，得到m/z285.038 67 [M+H-H2O]+，接着脱去一个CO，得到m/z257.043 55 [M+H-H2O-CO]+，再脱去一个CO，得到m/z229.049 01 [M+H-H2O-COCO]+。根据文献[14]报道，符合槲皮素的裂解规律，与Mass Frontier 中匹配二级碎片离子一致，鉴定其为槲皮素。化合物31 在ESI-模式总离子流图下得到m/z269.046 11 [M-H]-的分子离子峰，拟合分子式为C15H10O5，脱去一个CO2，得到m/z225.055 50[M-H-CO2]-，母离子C 环发生RDA 重排裂解，得到m/z151.054 40 [M-H-C8H6O]-。根据文献[9]、[14]报道，符合芹菜素的裂解规律，与Mass Frontier 中匹配二级碎片离子一致，鉴定其为芹菜素。

图8 正离子模式下芦丁可能的裂解途径及二级质谱图

2.3.3 氨基酸、有机酸等酸类化合物的鉴定

在正负离子模式下，共鉴定出4 种氨基酸类、14 种有机酸类化合物。以化合物6 为例，在ESI+模式总离子流图下得到m/z182.080 89 [M+H]+，拟合分子式为C9H11NO3，以此为母离子进行二级质谱分析，脱去一个羟基，得到m/z165.054 28[M+H-OH]+，母离子脱去一个NO2，重排裂解得到m/z136.075 45 [M+H-NO2]+。根据文献[5]报道，符合酪氨酸的裂解规律，与Mass Frontier 中匹配二级碎片离子一致，鉴定其为酪氨酸。

有机酸的脂肪酸类以化合物5 为例，在ESI-模式总离子流图下得到m/z191.019 17 [M-H]-的分子离子峰，拟合分子式为C6H8O7，以此为母离子进行二级质谱分析，脱去一个H2O，得到m/z173.008 59[M-H-H2O]-，脱 去CH4O4，得 到m/z111.007 38[M-H-CH4O4]-，母离子脱去两个羧基，得到m/z101.023 00 [M-H-2COOH]-。根据文献[5]、[11]报道，符合柠檬酸的裂解规律，与Mass Frontier 中匹配二级碎片离子一致，鉴定其为柠檬酸。

有机酸的酚酸类化合物以化合物9 为例，在ESI-模式总离子流图下得到m/z153.018 39 [M-H]-的分子离子峰，拟合分子式为C7H6O4，以此为母离子进行二级质谱分析，脱去一个CO2经重排裂解，得到m/z109.028 17 [M-H-CO2]-，再脱去一个氢，得到m/z108.020 19 [M-H-CO2-H]-。通过与对照品比对和文献[5]、[9]报道，符合原儿茶酸的裂解规律，与Mass Frontier 中匹配二级碎片离子一致，鉴定其为原儿茶酸。

2.3.4 其它化合物的鉴定

在正负离子模式下，共鉴定出4 种其它类化合物。化合物23 在ESI+模式总离子流图下得到m/z193.049 09 [M+H]+的分子离子峰，拟合分子式为C10H8O4，以此为母离子进行二级质谱分析，脱去一个甲基，得到m/z178.024 95 [M+H-CH3]+，脱去一个CO，得到m/z165.054 33 [M+H-CO]+，接着脱去一个CO，得到m/z137.059 17 [M+H-CO-CO]+，母离子脱去C2H4O2，经重排得到m/z133.064 64[M+H-C2H4O2]+。根据文献[5]、[13]、[15]报道，符合东莨菪内酯的裂解规律，与Mass Frontier 中匹配二级碎片离子一致，鉴定其为东莨菪内酯。

3 结语

柴胡作为传统中药材，现代药理研究表明柴胡具有抗炎、抗肿瘤、抗病毒、免疫调节等功能，这些药效作用源于其主要成分如皂苷类、黄酮类等成分等。笔者采用UPLC-Q-Exactive Orbitrap MS 技术快速鉴定柴胡的化学成分，通过高分辨质谱数据、标准品对照、文献检索、Mass Frontier 验证、ClogP值对比，共鉴定出65 种成分，其中4 种为首次从该植物发现的化学成分，如壬二酸、3，5，6-三羟基-4’，7-二甲氧基黄酮、13-羟基-9，11-十八二烯酸、甲氧基-十五烷酸。本研究可快速鉴别柴胡化学成分，从而为质量控制方法的建立提供实验依据，但不同皂苷的结合部位及同分异构体通过质谱尚不能完全确定结构，有待于进一步研究。